Abstract
間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、生体工学や再生医療に大きな約束を保持します。 MSCは組織培養プラスチックへの強い付着を介して複数の成体組織から単離し、次いで、さらに最も一般的にウシ胎児血清（FBS）を使用して、 インビトロで増殖することができます。 FBSは、MSCは、免疫原性になる可能性がありますので、MSC培養物におけるその存在は、細胞の臨床的および実験的なアプリケーションの両方を制限します。したがって、MSC培養のために化学的に定義された異種非含有（XF）メディアを用いた研究は非常に価値があります。 MSCの多くの有益な効果は、主に腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）及びプロスタグランジンE2（PGE2）などの免疫調節因子の分泌を介して、炎症及び免疫を調節するそれらの能力に起因しています。しかし、MSCは、これらの要因を生成するために活性化を必要とMSCの効果は、多くの場合、一過性であるため、大きな関心は、事前活性化細胞PRIOの方法を発見するために浮上していますそれらの使用rは、このように生体内での活性化のためのタイムラグを解消します。ここでは、3次元（3D）培養液で効率的に活性化するためのプロトコルやプライムMSCを提示します 化学的に定義されたXFの条件下で生体内でのこれらの予め活性化MSCを投与します。具体的には、まずXF培地を用いて球状MSCマイクロ組織または懸滴の「スフェロイド 'を生成し、球及び馴化培地（CM）は、様々な用途のために収穫することができる方法を示すための方法を説明します。第二に、我々は、遺伝子発現の画面を説明し、 インビトロでの機能アッセイは、迅速に細胞の抗炎症性及び抗癌の可能性を強調し、スフェロイドにおけるMSCの活性化のレベルを評価します。第三に、我々は、in vivo効力試験のためのマウス腹腔内にそのままMSCスフェロイドを注入する新規な方法を説明します。全体的に、プロトコルは、本明細書中で化学的に定義されたXF詐欺の下で予め活性化MSCを取得する主要な課題を克服しますditionsとは、治療のためのMSCスフェロイドを管理するための柔軟なシステムを提供します。
Introduction
間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、様々な再生医療のアプローチのための大きな可能性を示しています。 MSCは、最初は、骨髄の間質成分として単離したが、以降、脂肪組織1、2、3を含む多数の他の成体組織から得られました。興味深いことに、メイン単離方法は、ウシ胎児血清（FBS）の存在下で組織培養プラスチックにしっかりと付着するMSCの顕著な特性を包含する。この伝統的な分離技術は、2次元（2D）培養中のMSCの簡単かつ急速な拡大を可能にする一方で、それはまた、非常に人工的であり、重要な細胞特性4の潜在的な損失につながるネイティブ3次元（3D）環境の重要性を無視し、5 、6。したがって、3次元培養におけるMSCの研究では、どの従来の2D培養液より生理的であり、MSCの特性を「減少/失われた」の検索で浮上しています。また、大きな関心は、異種非含有（XFに）MSC培養および活性化のための化学的に定義された条件を特定し、ひいては臨床応用のための細胞がより容易にするために上昇しています。
多くの研究は、生体材料に、球状凝集体またはスフェロイドとして両方のMSCの3D培養を実証公開されています。 MSCのスフェロイド培養物は、前臨床または臨床試験における治療のための細胞の投与後の生体内での MSCの挙動を理解する方法として見られたのに対し、生体材料中のMSCは、最初に、細胞を播種した足場で損傷した組織を置き換えるために組織工学的アプローチのために設計されました4、5、7。興味深いことに、MSCのフォームスフェロイドは自発的に組織培養プラスチックへの付着は認められていないとき8、9、10。伝統的に、細胞凝集は、スピナーフラスコ法または液体オーバーレイ技術、腫瘍微小環境を模倣しようとする努力において、癌生物学において最初に使用される方法によって容易にしました。より最近では、追加の方法は、細胞へのプラスチック接着4、5、6を防止するために特定の化学薬品で予めコーティングした培養皿に細胞凝集を示すこと浮上しています。 MSCスフェロイドを生成するための最も単純で経済的な方法の一つは、多くの場合、胚性幹細胞から胚様体を生成するために使用された技術、懸滴培養それらです。ドロップ培養技術をぶら下げて、組織培養プラスチックへの細胞接着は、組織培養皿の蓋の下側に媒体の液滴で細胞を懸濁させ、重力が細胞aggregを促進させることによって防止されますドロップの頂点でエーション。スフェロイドの大きさを容易に制御することがハンギングドロップ培養は、特に容易にする、細胞濃度または滴体積を変えることによって操作することができます。
MSCの3D培養に関する初期の研究では、対応する2D 6、8、9と比較して、3Dでの細胞の特性のラジカル違いを実証しました。同時に、レポートは、 インビボでのMSCの有益な効果は、微小環境の合図によって活性化され、反応して、抗炎症性および免疫調節11因子生成するためになる能力に頼っていることを実証しました。興味深いことに、そのようなプロスタグランジンE2（PGE2）などのこれらの因子の多くは、腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）、および肝細胞増殖因子（HGF）のための道を開く従来の2DのMSCよりMSCスフェロイドによってはるかに大量に生産されましたのアイデア細胞8、12、13を活性化するために、3D培養物を使用して。また、3次元培養における遺伝子活性化は、マウス12への注入後に少なくとも部分的に、細胞活性化の、メカニズムを再現するように見えました。 インビボでの伝統的なMSCの効果は、多くの場合、遅延、過渡、および「ヒットして実行」と記載することができるされているように、実験での使用の前にMSCを活性化することによって、細胞の効果を延長し、より目立つことができます。過去数年の間に、MSCスフェロイドを用いて重要な機能的研究は、これらが炎症反応を抑制し、そのようなスフェロイドをプライミングしたMSC 2の魅力的な形を作る、マクロファージ、樹状細胞、好中球、およびT細胞などのエフェクター細胞に影響を与えることによって、in vivoで免疫を調節することができることが実証されています、3。また、intなどの抗癌分子の産生erleukin-24（IL-24）および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、MSCを単層にMSCの相対的な3次元培養で標的癌治療8、10、14のために利用することができる現象が増加します。
組織培養プラスチックの使用だけでなく、FBSのみならず、必要な従来のMSC培養物として、臨床使用のためにMSCのスフェロイドをより容易にする別のハードルを克服しなければなりませんでした。この障害に取り組むために、我々は最近、特定の下MSCスフェロイドの形成は、化学的にXFの条件を定義し、得られたMSCのスフェロイドをFBS 14との条件で生成されたスフェロイドのような抗炎症同じと抗癌分子を生成するために活性化されたことが確立さを示しました。ここでは、これらの知見は、XFを使用して3D培養物で予め活性化MSCの生成を実証するいくつかの詳細なプロトコールに提示されていますメディア。また、プロトコルは共にマウスに完全な球状体を送達するための実用的な方法で、それらの抗炎症性、免疫調節性及び抗癌効果に関しては、MSCの活性化レベルを評価するための効果的な方法を説明し、その提示されています。
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Protocol
1. MSCの単離と拡大
- 調製および成体幹細胞の分布（のためのセンターからの早期継代MSCを得るhttp://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ）15などの冷凍バイアル。また、冷凍バイアルなどの日常のプロトコル14およびストア次の骨髄吸引からMSCを分離します。
- 15から20パーセントのプレミアムを補充した最小必須培地アルファ（αMEM）はFBS、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン - ストレプトマイシンを選択している完全培地（CCM）を、準備します。濾過により培地を滅菌します。
- 150 mmの細胞培養皿にCCMを30mlを入れ、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で30分間皿をインキュベートします。
- 37℃の水浴中で2分間、約10 6 MSCを含む凍結バイアルをインキュベートします。
- 5 mlの血清学的ピペットを用いて培養皿にバイアルの内容物を移し、残存する細胞を捕捉するために皿中1〜mLのCCMでバイアルを数回洗浄します。適切なインキュベーターに皿一晩置きます。
- 注意深く室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回培養を洗浄し、予め温めておいた0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液3mlでMSCを取り外します。支隊は通常インキュベーターで約3〜4分かかります。
- 37℃に予熱した6 mlのCCMと皿にトリプシンを中和し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。細胞収率を最大化するためにPBSの洗浄液と組み合わせます。
- 室温で10分間、細胞（450×gで）を遠心分離し、上清を吸引します。
- CCMの小容量で細胞を再懸濁し、血球計およびトリパンブルーを用いて生細胞を数えます。
- 100細胞/ cm 2で150 mmディッシュの適切な数をシード
- トリプシン/ EDTAを用いて上記のように細胞を採取し、適切な培地で単一の円錐チューブにすべてのセルを結合します。遠心分離機は、再び細胞数に対して同じ少量の培地に細胞を再懸濁します。標準CCM（FBS含有）またはXF中1（XFM-1）とし、ヒト血清アルブミン（HSA、13せずに両方のXF培地-2（XFM-2）と呼ばれる、ここで、種々の市販のXFメディア製剤を使用mg / mlで）補足。
XFの条件の下で3-Dハンギングドロップ培養における活性化MSCスフェロイドの作製
- 、約25,000細胞のスフェロイドを生成する714個の細胞でCCM、XFM-1、XFM-1 + HSA（13 mg / mlで）、XFM-2、またはXFM-2 + HSA（13 mg / mlで）に収穫したMSCを希釈するために、 /μlの。
- 上への細胞のピペット35μL/滴培養皿の蓋を反転さ150ミリメートルの下。複数の液滴は容易にマルチチャンネルピペットを使用してピペットできます。
注：より大きな又はより小さな球状体が望まれる場合、適切に細胞濃度または滴体積（25-45μl）を変更します。 - 皿のベースに室温PBSの20ミリリットルを転送し、1の連続と安定した動きでドロップ頂点が下を向くようにすることを、滴を含む、蓋を反転。培養皿の底に慎重に蓋を置きます。
- 適切な球のアセンブリを可能にするために、それを乱すことなく3日間インキュベーターに皿を転送します。
- 72時間後、慎重に蓋を除去し、液滴が、再び、上向きになるように、それを反転させて回転楕円体の収穫を開始。
- 角度は約10から20°に蓋とは、セルリフターを用いてプレートの端に、スフェロイドを含む、液滴を押してください。
- 1,000μlの管を15mLのコニカルチューブ中球と媒体を移送TTE。プレートを洗浄し、スフェロイドの最大の回復を確実にするために、室温PBSと同じチップを用いてピペットを使用してください。
- リアルタイムPCRアッセイ（プロトコル3）のために、室温で5分間、450×gで球体懸濁液を遠心分離し、上清を吸引します。 PBSでスフェロイドを洗浄し、両方の遠心分離および吸引の手順を繰り返します。動物（プロトコル8）への送達のために、球は、遠心分離することなく、チューブ（〜3-4分）の底に定着することができます。
抗炎症及び抗癌マーカーの3リアルタイムPCR
- PBSで洗浄し、遠心分離した単層のMSC（プロトコル1）とMSCスフェロイド（プロトコル2）からのDNAフリーのトータルRNAを単離するために、ホモジナイザー列を持つRNA抽出キットおよびRNaseフリーのDNaseセットを使用してください。
- βメルカプトエタノールを含むRLT緩衝液（1：100）で溶解別々の15ミリリットルの各条件から少なくとも10万の単層MSCおよび20スフェロイドコニカルチューブ。
- トランス1.5ミリリットルRNaseフリーのチューブに完全に混合溶解物をFERと回転楕円体の溶解を助けるために、冷凍庫（-80℃）のために少なくとも3時間に配置します。
- 、氷上で細胞溶解物を解凍簡単にボルテックスし、市販の哺乳動物の全RNA単離キットを用いてRNAを単離するための製造元の指示に従ってください。
- 定量化し、分光光度計を使用して単離されたRNAの品質を評価します。
- リアルタイムPCRのためのcDNAを生成するための製造元の指示に従って大容量のcDNA逆転写キットまたは同等のものを使用してください。
- 氷上でcDNAサンプル、商業的に設計されたリアルタイムPCRプライマー/プローブ（遺伝子発現アッセイ）、およびPCRマスターミックスを置きます。 GAPDH（対照）、PTGS2（COX-2、抗炎症）のためのプライマー/プローブを使用して、TNFAIP6（抗炎症TSG6）、TRAIL（抗癌）、およびIL-24（抗癌）。
- 遺伝子発現アッセイおよび高速Univeための製造元の指示に従って、リアルタイムPCR反応を準備RSALマスターミックス。
- 実験の文書を生成し、実行を実行するためのリアルタイムPCR機器のためのガイドラインに従ってください。
- ベースライン8、14などの内因性制御と単層のMSCとしてGAPDHを用いた遺伝子発現の相対的変化（相対量、RQ）を計算することにより、ΔΔCT法を使用してデータを分析します。
4.免疫調節のアッセイのためのCMの収集と抗がんの可能性
- しかし、セルリフターやピペットを用いて、15ミリリットルコニカルチューブに上記のように、これはCMを希釈しますようにPBSで皿の蓋を洗っていない、スフェロイドとCMを収穫。
- 慎重にピペットで無細胞上清を収集し、室温で5分間、450×gで遠心分離し、1.5 mlチューブに上清を移します。
- 慎重にCLを収集し、室温で5〜10分間万×gで遠心分離ピペットでCMをarified、および（-80°C）の冷凍庫での保存のための新しい1.5 mlチューブにCMを移します。複数のアッセイのためにそれを使用する際に凍結前にCMのアリコートを準備します。
注：前下流アッセイを行うために、PGE2濃度は、CMの抗炎症能力の良好な指標は、製造業者の指示に従って市販のELISAキットを用いて決定することができます。 TSG6濃度は、公表されたプロトコル14を使用して決定することができます。
5.マクロファージアッセイは、MSC-CMの抗炎症の可能性を評価します
- L-アラニル-L-グルタミンを含有FBS及び1×ペニシリン - ストレプトマイシンを選択し、10％のプレミアムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）から成るマクロファージ媒体を準備します。フィルター滅菌培地を。
- 約10 6 J774マウスマクロファージの凍結バイアルを入手し、37℃の水浴中で2分間バイアルをインキュベートします。
- 吸引した上清は、マクロファージ培地1mlにマクロファージを中断し、マクロファージ培地30mlを含む150ミリメートルのペトリ皿にマクロファージを移します。
- 2日ごとに培地を変更して、約70から80パーセントのコンフルエントになるまでインキュベーター中で細胞をインキュベートします。
注：マクロファージは、このように培地交換で細胞を紛失しないよう注意が払われるべきである、シャーレに強固に付着しません。 - ピペットで細胞上にマクロファージ媒体を噴霧することにより、マクロファージを収穫。 200〜300×gで、室温で5分間、50mLのコニカルチューブと遠心分離機に細胞を移します。
- 上清を吸引除去し、血球計で細胞数のためのマクロファージ少量の培地に細胞を懸濁。マクロファージ私と一緒に200,000細胞/ mlに濃度を調整しますdium。
- マクロファージアッセイ用にセットアップを開始するには、12ウェルプレートのウェルにマクロファージ培地480μlを添加します。
- 非刺激対照ウェルにマクロファージ培地20μlを添加して、20μlの非馴化または培地をMSC馴化、実験ウェルに、上記で調製しました。プレートを叩いてウェル中の培地を混ぜます。
- 非刺激マクロファージ対照ウェルにマクロファージ細胞懸濁液の500μlのを転送します。
- 0.1ミリグラムの1,000 / mlのリポポリサッカライド（LPS）、室温で5〜10分間インキュベートする：500-1：1を加えて残りのマクロファージを刺激します。
- エアコン非またはMSC馴化培地でウェルに刺激されたマクロファージの500μlのを転送します。着実にプレートを数回揺動によってウェルを混ぜます。
- 16-18時間インキュベーターにプレートを転送します。
- 室温で5分間、500×gでマクロファージ馴化培地と遠心分離機を収穫。
- 転送製造業者の指示に従って市販のELISAキットによる腫瘍壊死因子-α（TNF-α）およびインターロイキン10（IL-10）は、コンテンツのための新しいチューブアッセイに上清。
スフェロイド-CMの免疫調節可能性を評価するための6脾細胞アッセイ
- 10％熱不活化FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン、及び2-メルカプトエタノールを補充したローズウェルパーク記念研究所（RPMI）-1640培地で構成されて完全な脾細胞培地を準備します。フィルター滅菌培地を。
- 脾臓の上腹部の左側に用意切開部を介して安楽死させ、雄のBALB / cマウスから収穫脾臓、約前面の中間に脚14を後肢。脾臓細胞14を分離するために70μmのセルストレーナーに脾臓を転送します。
- 滅菌シャーレusinに70μmのストレーナーを通して脾臓を押すことにより、脾臓細胞/リンパ球を単離します2〜3ミリリットルシリンジ14からプランジャのグラム柔らかいゴム/プラスチック終わり。脾臓を解離するために研削円運動を使用してください。
- 冷PBSで細胞ストレーナーを数回洗浄し、50mlコニカルチューブにペトリ皿から細胞を移します。 10分間4℃で冷PBSと遠心分離（500×gで）でチューブを埋めます。
- 上清を吸引し、5〜10 mlをインキュベートすることによって赤血球から5〜10分間（脾臓あたり）赤血球溶解液を細胞をオフにします。
- 500×gで5〜10分間、4℃でチューブと遠心分離機に冷PBSを加えることによって、溶解を停止します。
- 完全脾細胞培地中で単離された細胞を一時停止し、40μmのストレーナーで濾過し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 10 6細胞/ mlの最終細胞濃度を達成するために、細胞懸濁液に脾細胞培地を追加
注：この方法は、典型的にはマウスの脾臓あたり約3×10 7脾細胞が得られます。 - 転送10 6脾細胞（刺激または非刺激）1の最終希釈でウェルに12ウェルプレートのウェルに非馴化（コントロール）を追加したり、MSC-CM：10-1：20。
- 室温で5分間、500×gで24時間遠心分離後の脾細胞のCMを収穫。
- 製造業者の説明書に従って市販のELISAキットにより、インターフェロンγ（IFN-γ）のコンテンツを新しいチューブおよびアッセイに上清を移します。
スフェロイド-CMの抗癌の可能性を評価する7.前立腺癌アッセイ
- 10を補充したRPMI-1640培地で完全RPMI増殖培地を準備％FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン。
- LNCaP前立腺癌細胞の凍結バイアルを得て、37℃の水浴中で2分間バイアルをインキュベートします。
- 電動式ピペッターと5ミリリットル血清学的ピペットを用いて完全RPMI増殖培地の30ミリリットルを含む培養皿にバイアルの内容を転送します。皿から培地でバイアルを数回洗浄し、インキュベーターに皿を置きます。
- 細胞がコンフルエントに達する直前に、室温PBSで2回文化を洗い、予め温めておいた0.25％トリプシン/ EDTA溶液3mlでLNCaP細胞を切り離します。
- 完全RPMI増殖培地で皿でトリプシンを中和し、50mlコニカルチューブ内に洗浄液とともに細胞を移します。
- 室温で10分間、450×gで細胞を遠心分離し、上清を吸引します。
- 完全RPMI増殖培地の小さなボリュームに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いてがん細胞をカウントします。
- 細胞増殖アッセイキットを用いて細胞増殖アッセイを行うために、ウェルから培地を吸引し、少なくとも3時間、冷凍庫（-80℃）中にプレートを移します。
- プレートを解凍し、180ミリモルのNaCl、1mMのEDTA、および0.2 mg / mlでのRNase Aを含有する細胞溶解試薬100μlを加えることにより、各ウェル中の細胞を溶解
- 標準曲線のために、LNCaP細胞の溶解既知量の上記のように。
- 1時間後、1を含む1×細胞溶解緩衝液100μlを追加：細胞増殖アッセイ試薬100希釈し、細胞量を決定するために、各ウェルの蛍光を測定します。
無傷スフェロイドの8腹腔内送達
- （プロトコル2）を再懸濁さt上記のように回転楕円体のMSCを準備彼は、XFの条件を維持するために、0.2〜0.5％HSAを補充した滅菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中球。溶液中のHSAは、注入中にプラスチックに球付着を防止するのに役立ちます。
- 15ミリリットルコニカルチューブに40から120スフェロイドを移し、チューブに6ミリリットルHBSS / HSAを追加することによって、細胞を洗浄。球が下降するための3-4分を許可します。各動物のスフェロイドの独立したコニカルチューブを準備します。また、必要に応じて（下記の8.19を参照）追加の回転楕円体の保持を決定するアッセイのためのスフェロイドのチューブ（以下8.18を参照）、転写後の治療因子の産生を準備します。
- 、上清を吸引除去し、無菌のHBSS 100-200μlのスフェロイドをオーバーレイは0.2から0.5パーセントHSAを補充し、チューブを氷上に置きます。
- 簡潔には、誘導チャンバ内の約2分のピンチつま先の反射が消失するまで、100％酸素中2％イソフルランで動物を麻酔。
- BSL-2キャビネット、背ASPEの内側に動物を配置しますノーズコーンを介して1.5％イソフルラン/酸素混合物の連続的な流れで、（腹側を上に）ダウンCT。
- 防腐剤のような70％アルコールで下のマウスの腹部をきれいにしてください。
- 20 Gの静脈内（IV）カテーテルのキャップを外し、カテーテル小剣アセンブリと腹腔内注射を行います。注入を行うために、マウスの皮膚と別のものを保持するために片手を使用してください。正中線に向かって指して、針の先端に屈曲し、膝関節や陰部を結ぶ人工ラインのほぼ中央に注入点を見つけます。
注：カテーテルスチレットアセンブリは、通常の針よりも高い抵抗を有し、そのためのケアは、内臓への損傷につながる可能性がある、あまりにも深い腹部に針を注入しないように注意しなければなりません。皮膚の浸透そしてその後、筋肉/腹膜カテーテル留置中に感じることができます。 - 静かにカテーテルスチレットアセンブリから金属スティレット/針を取り除きます。 CHEC血液、尿や糞のための小剣をkおよびそれを捨てます。針に血液が内部器官（複数可）の穿刺を示しています。
- 流体の流れを可能にするために、注射時の直立位置にあるプラスチック製のカテーテルを保持します。
- 100-200μlの先端にピペットを用いて、カテーテルを通して滅菌HBSS / HSAの約100μLを注入することによって、プラスチック製のカテーテルの適切な配置を確認してください。気密シールを形成するカテーテルシリンジアダプタ内部のピペットチップの先端を置きます。ゆっくりと腹腔内の流体を注入します。
注：適切に配置カテーテル内の流体が自由にカテーテルのわずかな調整で腹膜腔の内側に流れます。不適切なカテーテルの留置（皮下または内腸、または針の先端は、腎臓などの腹膜臓器を負傷した場合）は、抵抗を増加し、流れを減少します。皮下配置は、皮膚の下に明らかな「バブル」の形成をもたらすであろう。 - トンを収集彼は、200μlのピペットチップを使用して、HBSS / HSAの100から200μlを（ステップ8.3）で調製したスフェロイドを、MSC、および上記のようにカテーテルを介して腹腔内に球体（40〜120球）のボリューム全体を転送します。
- 任意の残留スフェロイドを収集し、腹腔内にそれらを注入するために、上記と同じチップを用いてHBSS / HSA100μlので球を含むチューブを洗浄します。
- （オプション）は、カテーテルを洗浄するために腹腔内にHBSS / HSAの追加の100μLを注入します。
- カテーテルの上に消毒に浸したガーゼパッドを置き、ゆっくりと腹腔からカテーテルを除去し、それを捨てます。
- ゆっくりスフェロイドの均一な分布を確実にするために、指で腹膜腔をマッサージ。
- 動物は厳重な管理の下で回復し、注射部位からの出血のために見てみましょう。
- 残りのスフェロイドのためのカテーテルと15ミリリットルチューブを点検します。のいくつかの球を観察するようにするのが普通ですカテーテル/チューブ。
注：MSCスフェロイドの送達のために記載された技術は、正常動物または損傷モデルの様々な使用のために採用することができます。この技術は、正常マウス角膜損傷及び内毒素血症モデルにおける、ならびにザイモサン誘発性腹膜炎モデル8にスフェロイドを注入するために使用されています。 - （オプション）保持スフェロイドの数を定量化するために、DNAベースの細胞数の定量キット/試薬を使用しています。 15ミリリットルチューブの上に使用されるカテーテルを保持し、激しくバック15ミリリットルチューブに残っている球を強制するためにカテーテルを介してHBSS / HSAを分配します。
- 遠心分離を室温で5分間、500×gで15mlチューブ、上清を吸引します。冷凍庫（-80℃）のために少なくとも3時間に回転楕円体のペレットを含むチューブを転送します。
- チューブを解凍し、180ミリモルのNaCl、1mMのEDTA、および0.2 mg / mlでのRNase Aを含有する細胞溶解試薬を500μlを添加することにより球体を溶解
- 制御、FREのため上記のように（単一注射用に調製スフェロイドの数に好ましく相当）スフェロイドの既知量をエズと溶解。
- キットからの細胞増殖アッセイ試薬の1:50希釈液を含有する1×細胞溶解緩衝液100μlを1時間後に、96ウェルマイクロプレートに、二重に、細胞溶解物の100μlのを転送し、各ウェルに加えます。 10分後、対照試料との実験試料（複数可）を比較することにより、注入されなかった球の数を決定するために、各ウェルの蛍光を測定します。
- 転送球によって産生されるPGE2とTSG6の濃度を測定することにより、注射（オプション）のために準備スフェロイドの活性化レベルを評価します。移送2％FBS及び1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した1または2ミリリットルαMEM含む12ウェルまたは6ウェルプレートに、上記のようにカテーテルを通して40~120球、。 6時間インキュベーターでプレートを置きます。
- からメディアを転送井戸1.5または15ミリリットルのチューブに6時間後、室温で5分間、450×gでチューブを遠心します。
- 室温で5〜10分間万×gでピペットと遠心分離機を使用して、新しい1.5 mlチューブに、無細胞上清を移します。
- 製造元の指示に従って市販のELISAキットを使用して、PGE2濃度（CMの抗炎症の可能性の良い指標）のための新しい1.5 mlチューブ、アッセイに明らかにしたCM（上清）を転送します。 TSG6濃度は、公表されたプロトコル14を使用して決定することができます。
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Representative Results
現在の研究では、ハンギングドロップ培養は、コンパクトな球状のミクロ組織またはXF条件下で活性化されたMSCの「スフェロイド」を生成するために使用しました。 図1の治験ロードマップは、MSCは、スフェロイド、またはCMが球由来の治療因子を装填した後、自己集合72時間懸滴中に懸濁させたときにスフェロイドにに奨励されていることを示して、収集され、潜在的の両方で利用することができます研究と臨床応用。球産生のために必要とされる多数のセルは、1cm 2当たり100〜200セル、典型的には、低密度でMSCを播種することにより、一週間以内に取得し、その後約80％コンフルエント（ 図2になるまで6-7日間、細胞を増殖することができ）。細胞増殖動態は、日々の生存細胞を計数することによって決定さ、堅牢な拡大期（日3-7）1-2日の短い誘導期（ 図2Cを<以下のことが示されました/強いです>）。継代2または3のMSCは、典型的には、CCMで培養百万凍結保存細胞の単一バイアルから50から100000000の細胞を生み出します。
拡大と収穫後、MSCは通常、マイクロリットル当たり500〜1,000細胞、スフェロイドを生成するために、高い細胞濃度で懸濁されています。ハンギングドロップ培養は、その後反転し、適切に皿（ 図3）のベース上に配置されている組織培養皿の蓋の下面にMSCを含む培地の25〜40μlの液滴を移送することによって調製されます。 1μl当たり714個の細胞でCCMの35μlの滴に懸濁した場合（ すなわち 、ドロップあたり25,000細胞）を、MSCはまず、最終的にドロップ（ 図3C）の頂点で72時間で単一のコンパクトな球体を生成するために合体小さな凝集体に組み立てます。スフェロイドはまた、MSCの拡張のために最適化された市販のXFメディアのいくつかのタイプで72時間にわたって形成します、ここではXFM-1およびXFM-2と呼ばれます。しかしながら、XFM-1における単一のコンパクトな球体の形成は13 mg / mlでヒト血清アルブミン（HSA）、CCM（ 図3D）での推定総タンパク質含有量を反映する濃度で補充を必要とします。単一のコンパクトな球は容易にHSAなしまたはタンパク質を含まないαMEM（ 図3D）に基本的なXFM-1に形成されません。球の組み立て中、MSC表現型の根本的変化（ 図4）、および適切な場合に化学的に定義されたXF培地（ すなわち XFM-1 + HSA）、多数の抗炎症因子は、PGE2とTSG6（ 図4C）を含む上方制御されるの発現。しかし、TSG6およびPGE2の産生が顕著にHSA（ 図4C）することなく、XFM-2またはXFM-1での球のように培養したMSCに増強されていません。特にこれらの抗炎症性因子、並びに抗癌因子TRAIL及びIL-24は、非常時T、MSCを単層にスフェロイドのMSC相対アップレギュレートされました彼はXFM-1組換えHSA（rHSAを）またはヒトの血液（ 図4D）から調製された臨床グレードHSA（cHSA）のいずれかを補充した中で培養した球体。
様々な培地製剤中で調製MSC球の治療可能性を評価するために、いくつかの実用的な試験は、（ 図5）が実行されます。スフェロイドの免疫調節特性は、最初のLPS刺激マクロファージ及びCD3で刺激された脾細胞/リンパ球（ 図5）によって産生されるサイトカインのレベルに球CMの効果を測定することによってインビトロで決定されます。 MSCからのCMは、CCMで培養球体と同時に抗炎症性サイトカインIL-10（ 図5A及び5B）のレベルを高めながら、XFM-1 / HSAは著しく、マクロファージTNFα及びIFNγ脾細胞の産生を抑制しました。球の抗癌特性は、球CM Oの影響を測定することによって評価されますN成長およびLNCaP前立腺癌細胞の形態。 XF媒体XFM-1 / HSAを効果的にFBS含有CCM（ 図5Cおよび5D）に類似したLNCaPの増殖を減少させました。
重要なことには、無傷のMSC球（ 図6）は、 インビボでの細胞の抗炎症活性を試験するために、マウスの腹腔内に投与することができます。これらの実験のために、球はXF状態を維持しながら、プラスチック管への付着を最小限にHSAの低濃度を含有するHBSS中で注射用に調製されます。その後、球体は、容易に適切に標準の腹腔内注射のために配置針/カテーテルアセンブリ（ 図6Cおよび6D）を介して、ピペット（ 図6B）を用いて、回収管（ 図6A）から転送した後に注入することができます。このアプローチを使用して、MSCのスフェロイドは、定期的にすることができますそれらの完全性（ 図6Gおよび6H）を中断することなく、効率90％以上（ 図6Eおよび6F）に移しました。腹腔内にカテーテル先端の不適切なポジショニングが悪い球の配信と高い保持（ 図6F）につながります。重要なことは、ピペット/カテーテル内の球の保持のレベルを定性的に保持された球体を溶解し、市販のDNAベースの細胞定量試薬/キット（ 図6F）を用いて細胞数を測定/収集することによって定量的に目視検査によって決定される、またはすることができます。ポスト噴射球保持分析は、実験中に包含/除外基準を作成するのに役立ちます。特に、TSG6およびPGE2の高いレベルを分泌するCCMとXFM-1 / HSAスフェロイドのための能力は、ドロップ培養（ 図6I）をぶら下げから球の転送後少なくとも6時間を維持しています。それらのin vitro EFと同様に炎症誘発性TNFα（ 図6J）を減少させながら、すぐにLPS、強化されたPGE2および腹膜におけるIL-10レベルの静脈内投与により全身性炎症の誘発後のマウスの腹腔内に注入fects、XFM-1 / HSA球、。
図1：XF条件下での球状のマイクロ組織として下塗りされたMSCのsecretomeを利用するために開発されたプラットフォームの模式図。単層培養物（1）としての膨張に続いて、MSCはプライム/細胞を活性化するために、高い細胞濃度で培養皿（2）の蓋から懸滴中に懸濁されています。 72時間後、（3）馴化培地（CM）及び（4）完全なスフェロイドは、液滴から採取し、様々な下流の用途に利用することができるの両方。 CMは、免疫調節因子、ならびに他の治療COMPONが豊富ですエント。懸滴に形成コンパクトなスフェロイドが容易ピペット（5）を使用して転送され、効果的にカテーテル（6）を介してin vivoで投与することができます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：単層培養中の骨髄由来MSCの生育特性。通路2におけるMSCは、15cmの皿（皿当たり15,000細胞）およびCCMで7日間培養に低密度で（1cm 2当たり100個の細胞）を播種しました。培地は、5日目または6（収穫前に24〜48時間）に再び3日目に変更されました。細胞をプレーティングした後のMSC 3日（A）及び7日（B）の代表的な位相差顕微鏡写真。スケールバー=200μmです。 MSCの（C）増殖速度3人のドナーから得られたが、7日目に2日目から毎日、生存接着細胞の数を数えることによって決定した。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：XF媒体にMSCのスフェロイドをプライミングするためのドロップ文化をぶら下げの調製。技術を示す（A）の写真は、急速に組織培養皿の蓋の下面に懸滴層に。 （B）写真がぶら下がっを示すが反転し、ディッシュベースに蓋を位置決めした後に低下します。 （C）位相差顕微鏡により可視化懸滴における25,000 MSCの凝集の経時変化を。目的は、ドロップの頂点に集中していました。スケールバー=500μmの。 （D）いまし、HSAなしFBSとないαMEM（ すなわち CCM）、XFM-1 HSAとない、とXFM-2を含む様々な培地製剤を使用して、ドロップ培養をぶら下げで3日後に形成されたMSC球のGES。スケールバー=200μmです。パネルDのデータは、パブリッシャ14からの許可を得て、元の記事から入手しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：3-D XF培養におけるMSCの活性化の評価。 （A）球/ CMが/反転皿のふたを傾け、セルリフターを用いたエッジに液滴を強制することにより、72時間後に収穫されています。 25,000細胞から組み立て球は簡単に収集中に可視化することができます。 （B）approxiの写真多数の組織培養プレートの蓋から集め500球をmately。球は急速に遠心分離することなく、チューブの底に下ります。 72時間後MSC球から分泌されるPGE 2の（C）レベルをELISAによって測定しました。リアルタイムRT-PCRはTSG6レベルを測定するために使用しました。 TSG6とPGE2の両方がスフェロイドでMSCの活性化をスクリーニングするための貴重なマーカーです。 XF媒体XFM-1 + HSAは、PGE2とTSG6生産（赤箱）の高レベルを示しました。データは平均±SDとして示されており、（*** p <0.001、αMEMサンプルと比較して）スチューデントのt検定によって分析しました。 （D）PGE2 ELISAおよびCCMで生産球体上のリアルタイムRT-PCRアッセイおよびXFM-1ヒト静脈血から調製した13 mg / mlで組換えHSA（rHSAを）、または臨床グレードHSA（cHSA）と特異的に補足。倍変化は、接着性単層のMSC（RQ = 1）から決定しました。データは平均±SDとして示されており、（** P <0.01、*** P <0.001、と比較してスチューデントのt検定によって分析しました単層のMSC）。パネルCおよびDの一部のデータは、パブリッシャ14からの許可を得て、元の記事から入手しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： インビトロ機能アッセイでドロップ文化をぶら下げから収集したMSC-CMの抗炎症及び抗癌特性を評価します。 （A）LPS刺激マウスマクロファージ（MQ）によるTNFαおよびIL-10の産生に対する球CM（CCMとXFM-1 / HSA）の効果を示すELISA法から代表的な結果。 ELISAは、マウス脾細胞（SPL）によってIFNγの産生に球CM（CCMとXFM-1 / HSA）の効果を示すから（B）代表的な結果は、抗CD3抗体で刺激しました。 （C）CCMとXFM-1 / HSAで調製MSC球からの基本的なCCMとXFM-1 / HSAまたは馴化培地（CM）で処理したLNCaP前立腺癌細胞の位相差顕微鏡写真。 LNCaP細胞をRPMI培地（コントロール）中で培養しました。スケールバーは200μmです。 LNCaP前立腺癌細胞の増殖における（D）定量的変化は、商業的に入手可能なDNAベースの細胞定量試薬/キットを用いて決定しました。点線は、ウェル当たり5,000細胞の播種密度を示しています。すべてのパネルにおけるデータは、平均±SDとして示され、スチューデントのt検定（*** p <0.001）により解析しました。すべてのパネルの一部のデータは、パブリッシャ14からの許可を得て、元の記事から得ました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図6：無傷のMSCスフェロイドの効率的な転送、20G静脈針/カテーテルシステムを使用して、XF条件下で調製。 （A）が0.2％HSAを含むHBSS中で注射用に調製XFM-1 / HSA MSC球で15ミリリットルコニカルチューブの代表的な写真です。 （B）200μlのピペットチップに吸引した後、MSC球の代表的な写真。 （C）マウスに、無傷のMSCのスフェロイドを管理するために使用される20 G針/カテーテルアセンブリのイメージ。ポリウレタンカテーテルのアダプタにピペットチップの適切な位置決めを実証（D）イメージ。直ちに培養皿の中にカテーテルを介してそれらを通過した後、MSC球の（E）画像。約100のうち95球を移しました。マウスの腹腔内への球の送達の（F）効率が中に保持さ/溶解球を収集することにより決定しました溶解した球の完全な補完から得られた細胞の数に対する市販のDNAベースの細胞定量アッセイを介してピペット/カテーテルおよび測定セルの数、。赤い点線は90％の転送効率を示しています。悪い球配信（71％）は、一回の注射（矢印）で観察されました。パネルE（拡大図）中球の（G）位相差顕微鏡写真。スケールバー=200μmです。 （H）組織培養皿への転写後のXFM-1 / HSA球16時間の位相差顕微鏡写真。 MSCの線維芽細胞、紡錘状の形態は、球から遊走した細胞内で維持されます。スケールバー=200μmです。 TSG6およびPGE2がCMで行った抗炎症因子の（I）ELISAアッセイを2mlαMEM/ 2％FBSを含む6ウェルプレートに球の転写後6時間に収集しました。 XFメディアXFM-1 / HSAで調製した球体はTSG6とPGE2分泌（赤箱）の最高レベルを示しました。データは、平均値として表さ±SDは、スチューデントのt検定によって分析した（*** p <0.001、αMEMサンプルと比較して）。一部のデータは、パブリッシャ14からの許可を得て、元の記事から入手しました。 （J）スフェロイド能力を示す代表的なグラフは、エンドトキシン（LPS）を静脈内注射によりチャレンジしたマウスにおけるTNFαのレベルを減少させながら腹膜PGE2およびIL-10を増加させるために、腹腔内に注射しました。サンプルは、炎症および80スフェロイドの送達の誘導後に腹腔洗浄6時間によって得られました。データは、平均±SDとして、スチューデントのt検定によって分析した発現した（* p <0.05、対照と比較して、** P <0.01）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
いくつかの研究及び臨床用途に使用するための最適なMSCは非常に彼らの利益を最大化するために活性化され、好ましくは例えばFBS等の異種培地成分からの潜在的な抗原の送達を最小限にするために、化学的に定義されたXF条件下で調製されるべきです。ここに記載されたプロトコルでは、1の方法を示している）2）3）、それらの抗に関しては回転楕円体のMSCの活性化レベルを評価し、XF条件下でのMSCの3D活性化を達成するため、スフェロイドを形成することによって、3D培養におけるMSCを活性化します炎症、免疫調節、および抗がんの可能性、および4）マウスに、完全なスフェロイドなどの活性化MSCを提供します。
MSCは、骨髄および脂肪組織を含む多数の成体組織からプラスチック接着によって単離することができる多能性幹細胞です。 MSCは容易に表面マーカーの異なる組を表す、比較的高い（10~20％）FBS濃度の下で組織培養プラスチック上で増殖され、そして脂肪生成、骨形成、および軟骨形成系譜1、16、17、18に、少なくとも区別することができます。 MSCは、それらがインビボでの投与後にのみ一時的に持続するように思われるにもかかわらず、ヒト疾患の様々な動物モデルにおいて有益な効果を発揮することが実証されています。 MSCの効果は、したがって、「ヒットして実行」と呼ばれており、多くの場合、MSCは2によって分泌PGE2、TSG-6、およびインドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ（IDO）、抗炎症性および免疫調節パラクリン因子によって媒介されます、3、11、19、20、21。しかしながら、これらの要素を生成するために、MSCは、損傷した組織からの信号を介して、または免疫Cのいずれかから、活性化を必要と受信者のells。その後、動物または患者22への細胞の送達前に、MSCプレ活性化またはプライミングのプロトコルを開発する新興関心が集まっています。また、標準的なMSC製剤中の抗原FBS成分の存在が懸念を表明しました。したがって、研究では、MSC培養のための最適な化学的に定義されたXF条件を決定するために行われてきました。最近の研究では、最初のMSCは、スフェロイドを形成することにより、3Dで活性化され得ることを示し、次いで、細胞の活性化はまた、特定のXF条件8、12、13、14の下で達成することができることを発見しました。
三次元細胞培養技術は、細胞ベースの研究で真の生理学的条件を提供することを目的と何十年も使用されています。 2Dでの培養は、組織の3次元的な性質を無視し、したがって、常に再現していません細胞間および細胞シグナル伝達における重要な細胞 - マトリックス相互作用。多くの三次元培養技術は、回転容器、スピナーフラスコ、または種々の非接着表面を使用し、しかし、これらの方法の多くの最大の欠点は、生成された回転楕円体のサイズおよび/または特定の高価な装置の必要条件の不均一性です。研究はまた、本質的にMSCを促すハンギングドロップ培養物を使用して行われているに自発的に集合単一スフェロイド4、5、6、7、8、9、23に。注目すべきことに、ハンギングドロップ培養は容易に細胞濃度及び/又はドロップ量を調整することにより、細胞凝集体の大きさを操作することができるという付加的な利点を有する、比較的均一なミクロ組織/骨材のアセンブリを支持します。また、ぶら下げdの習得ROP培養技術は、広範囲の訓練を必要としません。 25-40μlの滴は容易に一般的に高い細胞濃度でのMSC、1μl当たり500〜1,000細胞を用いて調製することができます。より小さい20μlを迅速に蒸発する傾向があり、それらよりも大きい45μlのは、多くの場合、反転時に蓋を横切って汚れる削除します。任意のサイズ、スピードと方向性の液滴を含む蓋を反転するときしかし、表面張力およびドロップ/回転楕円体の適切な形状を維持するために考慮すべき重要なパラメータです。インキュベーター内で中断のない文化や適切な空気の流れは、各ドロップ内の単一の球にMSCの骨材を確保するために重要です。
この技術の欠点は、懸滴を含むプレートをインキュベーターに積層または球の組み立て中に移動し、患者の治療のためのスケールアップを困難にすべきではないということです。また、ドロップ文化をぶら下げ媒体を変更することが極めて困難である、このように長期培養は、AVでなければなりませんoided。また、懸滴の低いメディアと細胞の比率は、最終的に重要な細胞機能の喪失および/または細胞死につながる栄養枯渇、廃棄物の蓄積を引き起こす可能性があります。
しかし、適切な懸滴技術で、我々はスフェロイドにおけるMSCが、その中で細胞がIL-24の強力な抗炎症分子PGE2とTSG6だけでなく、抗がん分子の工場になると、高活性またはプライミングさになることが実証されていますTRAIL。我々は、MSCスフェロイドが実際に抗炎症性および免疫調節性であることを示し、培養マクロファージ、脾臓細胞、および前立腺癌細胞8、12、13、14を用いて、多数の機能的アッセイにおけるそれらの2D単層の対応物よりも優れた抗癌特性を有しています。さらに、我々は、投与された場合、MSCスフェロイドは強力な抗炎症効果を発揮することができることを示しています腹膜炎8を用いたマウスの腹腔内へ。具体的には、約400〜500ミクロン直径の大きいスフェロイド（25,000-30,000のMSCそれぞれ）が効率的に20G針/カテーテルアセンブリと標準ピペットを用いて、HBSS少量で送達することができることを示しました。この技術では、流体の流れに対する高い抵抗をもたらす不適切なカテーテルの配置を容易にプロトコールに記載のように、第1のHBSS / HSAの少量を注入することによって前スフェロイド転送に決定することができます。適切に配置カテーテルでスフェロイドはHBSSをプラスチックチューブに球の接着を最小限にするためにHSAを補充されていれば、自由に流動し、容易に可視化することができます。また、この技術は、注射のための標準的な針/注射器を使用して発生する可能性があります細胞にせん断応力を防止し、感染のリスクが高いを運ぶ、より技術的に困難である外科的切開の必要性を回避します。一つの主要な欠点は、トンでありますカテーテルを通して球移動に対する抵抗がくびれの分野で高いほどスフェロイドの帽子多くは、このような腹膜腔などの広々とした体腔に注入することができます。
我々は最近、ヒトの血液から得られたか、または組換え技術によって調製限りそれはHSAを補充したように、スフェロイドにおけるMSC活性の同じレベルが、特定の市販のXF培地を使用することによって達成することができることを実証XFM-1とここで呼ばれます14。 MSCのための最もXFメディアが最初に2Dでの細胞の最適な拡大のために処方されたせいか、MSCのスフェロイドは、XFメディア14のすべてのタイプでPGE2とTSG6の高いレベルを生成しないことをここで注意することが重要です。 HSAの異なるタイプは、それらの効力14に変化することに留意することも重要です。また、活性化されたスフェロイドのCMで検出されたPGE2の絶対水準は若干変化することができますPGE2のために使用されるELISAのようlyが実際に競合アッセイです。したがって、すべてのPGE2 ELISAに適切なコントロールを含むようにし、直接異なる時間に又は異なるプレートでアッセイしたサンプルの間でデータを比較することを避けることが重要です。また、MSCは、完全に吊りを調製する前にXF培地で洗浄されなければならない残留CCMを除去し、従って、FBS成分のキャリーオーバーを制限するために低下します。ここで説明するプロトコルは、容易に球形成および治療用遺伝子発現の他の培地処方物を評価するために採用することができます。
MSCは3Dで培養すると明らかに、通常の2DのMSCでは発生しない多数の細胞シグナル伝達イベントが運動に設定されています。細胞間および細胞-マトリックス相互作用、カドヘリンおよびインテグリンガイドスフェロイド形成とコンパクション24、25、26によって媒介され、回転楕円体の治療のための可能性が重要です。細胞集合体とCOなど多数の潜在的治療因子4、5の産生を生じるMSC活性化の過程で助け、マイナーアポトーシスを含むスフェロイド、様々なストレスシグナルへMPACT。我々は以前PGE2とTSG6 12のMSCの活性化や生産の自己分泌IL-1シグナル伝達の重要な役割を示しました。多くはMSC活性化における援助の様々なシグナル伝達経路については不明のままであるが、ハンギングドロップ培養プラットフォームは、この現象を研究し、MSCベースの治療を改善するための実用的な方法を提供します。全体として、我々は、抗炎症、免疫調節、および抗腫瘍因子を生成するために、ここではプロトコル、化学的に定義されたXF条件下で、活性化または3D培養においてMSCをプライミングする手段で、記載されています。我々はまた、これらのインタクトMSCスフェロイドがインビボで送達することができる方法を記載しています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80 °C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | in vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-γ (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, etc.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20 G , 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
References
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- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
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