Produzione e somministrazione di Therapeutic staminali mesenchimali / stromali cellulare (MSC) Spheroids innescato in Culture 3-D, in condizioni Xeno-free
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
Mesenchimali staminali / cellule stromali (MSC) sono molto promettenti in bioingegneria e medicina rigenerativa. MSC possono essere isolate da più tessuti adulti attraverso la loro forte aderenza alla plastica coltura dei tessuti e poi ulteriormente espanse in vitro, più comunemente utilizzando siero fetale bovino (FBS). Poiché FBS può causare MSC diventare immunogeno, la sua presenza nelle culture MSC limita sia applicazioni cliniche e sperimentali delle cellule. (XF) media liberi-xeno Pertanto, gli studi impiegando chimicamente definiti per le culture MSC sono estremamente preziose. Molti effetti benefici di cellule staminali mesenchimali sono state attribuite alla loro capacità di regolare l'infiammazione e l'immunità, soprattutto attraverso la secrezione di fattori immunomodulatori come fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6) e prostaglandina E2 (PGE2). Tuttavia, MSC richiedono l'attivazione per la produzione di questi fattori e dal momento che l'effetto di MSC è spesso transitoria, grande interesse è emerso per scoprire modi di pre-attivando le cellule prior per il loro utilizzo, eliminando così il tempo di ritardo per l'attivazione in vivo. Qui vi presentiamo i protocolli per attivare in modo efficiente o MSC primi tridimensionale culture (3D) in condizioni XF chimicamente definite e per amministrare questi MSC pre-attivati in vivo. In particolare, abbiamo prima descritto metodi per generare MSC sferica micro-tessuti o "sferoidi" in gocce appesi utilizzando media XF e dimostrare come le sfere e mezzo condizionato (CM) possono essere raccolte per varie applicazioni. In secondo luogo, descriviamo schermi di espressione genica e saggi in vitro funzionali di valutare rapidamente il livello di attivazione MSC in sferoidi, sottolineando il potenziale anti-infiammatori e anti-cancro delle cellule. In terzo luogo, si descrive un nuovo metodo per iniettare sferoidi MSC intatti nel mouse cavità peritoneale in vivo prove di efficacia. Nel complesso, i protocolli qui superare le grandi sfide di ottenere cellule staminali mesenchimali pre-attivato in chimica definita XF concondizioni e offrono un sistema flessibile per amministrare sferoidi MSC per le terapie.
Introduction
Staminali mesenchimali / cellule stromali (MSC) hanno mostrato un grande potenziale di vari approcci medicina rigenerativa. MSC sono stati inizialmente isolato come componente stromale del midollo osseo, ma da allora sono stati ottenuti da numerosi altri tessuti adulti, tra tessuto adiposo 1, 2, 3. È interessante notare che il metodo di isolamento principale abbraccia la notevole proprietà di MSC di aderire saldamente plastica coltura tissutale in presenza di siero fetale bovino (FBS). Sebbene questa tecnica tradizionale isolamento consente una facile e rapida espansione delle MSC in due dimensioni (2D) cultura, è anche molto artificiale e ignora significato del ambiente nativo tridimensionale (3D) che porta alla perdita potenziale di importanti caratteristiche cellulari 4, 5 , 6. Pertanto, lo studio delle MSC in colture 3D, chesono più fisiologico di culture 2D tradizionali, è emerso nella ricerca di "diminuiti perduti /" caratteristiche MSC. Inoltre, grande interesse è salito a identificare le condizioni (XF) senza xeno chimica definita per la cultura MSC e l'attivazione, e quindi rendere le cellule più suscettibili per le applicazioni cliniche.
Molti studi sono stati pubblicati che dimostrano la cultura 3D di MSC sia in biomateriali e come aggregati sferici o sferoidi. MSC in biomateriali sono stati inizialmente progettati per tecniche di ingegneria tissutale per sostituire i tessuti danneggiati con ponteggi cellule testa di serie, mentre le culture sferoidali di cellule staminali mesenchimali sono stati visti come un modo per capire il comportamento MSC in vivo dopo la somministrazione delle cellule per le terapie in studi pre-clinici o clinici 4, 5, 7. È interessante notare che, MSC formano sferoidi spontaneamente quando l'aderenza alla plastica coltura dei tessuti non è consentito8, 9, 10. Tradizionalmente, l'aggregazione delle cellule è stato facilitato da metodi pallone filatore o tecniche di sovrapposizione liquidi, metodi utilizzati inizialmente nella biologia del cancro negli sforzi per cercare di imitare il microambiente tumorale. Più di recente, ulteriori metodi sono emersi che dimostrano l'aggregazione delle cellule in piatti della cultura pre-rivestito con prodotti chimici specifici per prevenire cellula-plastica adesione 4, 5, 6. Uno dei metodi più semplici ed economiche per generare sferoidi MSC è loro cultura in gocce appesi, una tecnica che è stato spesso usato per produrre corpi embrionali da cellule staminali embrionali. Con appendere cultura tecnica goccia, l'adesione delle cellule alla plastica coltura tissutale è impedito sospendendo le cellule in una goccia di mezzo sul lato inferiore del coperchio coltura tissutale piatto e permettendo la gravità per facilitare AGGREG cellulezione nel vertice della goccia. La dimensione sferoide può essere facilmente manipolata cambiando la concentrazione cellulare o il volume di goccia, rendendo culture goccia pendente particolarmente facili da controllare.
I primi studi sulla cultura 3D di cellule staminali mesenchimali hanno dimostrato differenze radicali nelle caratteristiche delle cellule in 3D rispetto alle loro controparti 2D 6, 8, 9. Allo stesso tempo, i rapporti hanno dimostrato che gli effetti benefici di MSC in vivo affidamento sulla loro capacità di diventare attivato da stimoli microambientali e, in risposta, per produrre anti-infiammatori e immunomodulante fattori di 11. È interessante notare che molti di questi fattori come la prostaglandina E2 (PGE2), fattore di necrosi tumorale-stimolata gene 6 (TSG6), e il fattore di crescita degli epatociti (HGF) sono state prodotte in quantità molto più grandi da sferoidi MSC rispetto MSC tradizionali 2D spianando la strada per la idea diutilizzando colture 3D per attivare le cellule 8, 12, 13. Inoltre, l'attivazione genica in colture 3D apparve ricapitolare meccanismi, almeno in parte, di attivazione delle cellule dopo l'iniezione in topi 12. Attivando MSC prima del loro utilizzo negli esperimenti, gli effetti delle cellule potrebbero essere prolungati e più prominente come l'effetto MSC tradizionale in vivo è spesso ritardata e transitori, e può essere descritto come "mordi e fuggi". Nel corso degli ultimi anni, importanti studi funzionali utilizzando sferoidi MSC hanno dimostrato che essi possono sopprimere le risposte infiammatorie e modulare l'immunità in vivo influenzando cellule effettrici come i macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, e le cellule T che fanno sferoidi una forma interessante di MSC innescato 2 , 3. Inoltre, la produzione di molecole anti-cancro, come interleukin-24 (IL-24) e fattore di necrosi tumorale-correlati indurre apoptosi-ligando (TRAIL), sono aumentati in colture 3D di MSC rispetto al monostrato MSC, un fenomeno che potrebbe essere sfruttata per terapie antitumorali mirate 8, 10, 14.
Come la cultura tradizionale MSC richiesto non solo l'uso di colture di tessuto di plastica, ma anche FBS, un altro ostacolo per rendere sferoidi MSC più suscettibili per uso clinico aveva da superare. Per affrontare questo ostacolo, abbiamo recentemente dimostrato formazione di sferoidi MSC sotto specifiche condizioni XF chimicamente definite e stabilito che le sferoidi MSC risultanti sono stati attivati per produrre le stesse molecole anti-infiammatori e anti-cancro come sferoidi generati in condizioni con FBS 14. Qui, questi risultati sono presentati in diversi protocolli dettagliati che dimostrano la generazione di cellule staminali mesenchimali pre-attivati nelle culture 3D utilizzando XFmedia. Inoltre, i protocolli vengono presentati che descrivono metodi efficaci per valutare i livelli di attivazione delle cellule staminali mesenchimali per quanto riguarda le loro anti-infiammatorio, anti-cancro effetti, insieme con un metodo pratico per trasportare sferoidi intatte in topi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La MSC ottimale per l'uso in alcune applicazioni di ricerca e clinica deve essere altamente attivato per massimizzare il loro vantaggio, e preferibilmente prodotta in condizioni XF chimicamente definite per ridurre al minimo la consegna dei potenziali antigeni dai componenti di media xenogene quali FBS. Nei protocolli descritti qui, abbiamo dimostrato metodi a 1) attivare MSC nella cultura 3D dalla formazione di sferoidi, 2) ottenere l'attivazione 3D di cellule staminali mesenchimali in condizioni XF, 3) valutar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
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