제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
중간 엽 줄기 / 간질 세포 (중간 엽 줄기 세포)는 생명 공학 및 재생 의학에 큰 약속을 개최합니다. 중간 엽 줄기 세포는 조직 배양 플라스틱에 강한 접착을 통해 다수의 성인 조직으로부터 분리 한 후, 추가 가장 일반적으로 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여, 시험 관내에서 확장 될 수있다. FBS는 중간 엽 줄기 세포는 면역 원성가 발생할 수 있기 때문에, MSC 문화에서의 존재는 세포의 모두 임상 및 실험 응용 프로그램을 제한합니다. MSC 문화에 대한 따라서 연구는 화학적으로 채용하는 이종없는 (XF) 미디어는 매우 가치가있다. 중간 엽 줄기 세포의 많은 이로운 효과는 종양 괴사 인자 – 자극 된 유전자 6 (TSG6) 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)로 주로 면역 인자의 분비를 통해 염증 및 면역 조절 능력에 기인하고있다. 그러나, 중간 엽 줄기 세포는 이러한 요소를 생성하도록 활성화를 요구하고 중간 엽 줄기 세포의 효과는 종종 일시적이므로, 큰 관심은 세포 프리 오 미리 활성화시키는 방법을 발견하는 등장자신의 사용에 대한 연구, 따라서 생체 내에서 활성화에 대한 지연 시간을 제거. 여기에서 우리는 3 차원 (3D) 문화에서 효율적으로 작동하는 프로토콜이나 주요 중간 엽 줄기 세포를 제시 화학적으로 XF 조건 및 생체 내에서 이러한 사전 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 관리하는. 특히, 우리는 먼저 XF 매체를 이용하여 구형 MSC 마이크로 조직이나 매달려 방울의 '타원체'를 생성하고 분야와 에어컨 매체 (CM)는 다양한 애플리케이션에 수확 할 수있는 방법을 보여주기 위해 방법을 설명합니다. 둘째, 유전자 발현 화면 설명 및 시험 관내 기능 분석을 신속하게 세포의 항 염증 및 항암 가능성을 강조 타원체 MSC의 활성화 수준을 평가. 셋째, 생체 내 효능을 시험하기위한 마우스 복강 내로 그대로 MSC의 구 상체를 분사하기위한 신규 한 방법을 설명한다. 전반적으로, 프로토콜은 여기에 화학적으로 XF 콘에서 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포를 얻는 주요 문제를 극복ditions 및 치료에 대한 MSC의 타원체를 관리 할 수있는 유연한 시스템을 제공합니다.
Introduction
중간 엽 줄기 / 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 다양한 재생 의학 접근 방식에 대한 큰 잠재력을 보여 주었다. 중간 엽 줄기 세포는 초기 골수 간질 성분으로서 단리되었지만 사람의 지방 조직의 1, 2, 3을 포함하여 다수의 다른 성인 조직으로부터 수득 하였다. 흥미롭게도, 메인 분리 방법은 중간 엽 줄기 세포의 현저한 재산권 소 태아 혈청 (FBS)의 존재하에 조직 배양 플라스틱에 단단히 부착 품은. 전통적인 분리 기술은 2 차원 배양의 MSC 쉽고 신속한 팽창을 허용하는 동안, 그것은 오도 매우 인위적인 중요한 세포 특성이 (4)의 전위 손실로 이어지는 기본 3 차원 환경의 중요성을 무시 6. 따라서, 3D 문화에서 중간 엽 줄기 세포의 연구하는전통적인 2D 문화보다 더 생리있다 "손실 / 감소"MSC 특성에 대한 검색에 등장했다. 또한, 관심 임상 응용 프로그램에 대한 세포가 더 순종하게하여 MSC 문화 활성화를 위해 이종없는 (XF) 화학적으로 정의 된 조건을 식별하고 상승했다.
많은 연구는 생체 재료 및 구형 집합체 또는 회전 타원체로 모두 중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양을 보여주는 발표되었다. 중간 엽 줄기 세포의 타원체 배양 전임상 또는 임상 시험에서의 치료를위한 세포의 투여 후 생체 내에서 MSC 동작을 이해하는 방법으로 보였다 반면 생체 재료의 중간 엽 줄기 세포는 초기 셀 시드 지지체에 손상된 조직을 대체하는 조직 공학 방법을 위해 설계된 4, 5, 7. 흥미롭게도, 중간 엽 줄기 세포의 형태 타원체는 자발적으로 조직 배양 플라스틱에 부착이 허용되지 않는 경우8, 9, 10. 전통적으로, 세포 응집은 스피너 플라스크 방법 또는 액체 오버레이 기술, 종양 미세 환경을 모방하려고 노력 암 생물학에서 처음 사용 된 방법에 의해 촉진되었다. 최근 추가 방법은 배양 접시에서 세포 응집 세포 간 접착 수지 4, 5, 6을 방지하기 위해 특정 화학 물질로 미리 코팅 된 표면이 보여왔다. MSC의 타원체를 생성하는 가장 간단하고 경제적 인 방법 중 하나는 종종 배아 줄기 세포로부터 배아 체를 생성하기 위해 사용 된 기법에 매달려 방울 배양 그들이다. 드롭 배양 기술을 걸려, 조직 배양 플라스틱에 대한 세포 부착은 세포 aggreg을 용이하게하기 위해 중력을 조직 배양 접시 뚜껑의 밑면에 중간 방울에 세포를 현탁하고시킴으로써 방지드롭의 정점에 ATION. 회전 타원체 크기 용이 세포 농도 또는 액적 부피 변화를 제어하는 것이 특히 용이 매달려 드롭 배양함으로써 조작 될 수있다.
중간 엽 줄기 세포의 3 차원 배양에 대한 초기 연구는 2D 대응 6, 8, 9에 비해 3 차원 셀의 특성 라디칼 차이를 보였다. 동시에, 보고서는 생체 내에서 중간 엽 줄기 세포의 유익한 효과는, 응답, 마이크로 환경 단서에 의해 활성화 될 항염증제 및 면역 11 요인을 생성하는 능력에 의존하고 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 예컨대 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 종양 괴사 인자 – 자극 된 유전자 6 (TSG6), 및 간세포 성장 인자 (HGF) 등이 요인의 많은위한 방법을 포장 전통적인 2D 엽 줄기 세포보다 MSC의 타원체에 의해 훨씬 더 많은 양으로 생산되었다 아이디어세포를 8, 12, 13를 활성화 차원 배양을 사용. 또한, 3D 배양에서 유전자 활성화는 마우스 (12)에 주입 한 후 세포 활성의 적어도 일부분 메커니즘 요점을 되풀이 나타났다. 생체 내에서 전통적인 MSC 효과는 종종 과도 지연 및 "뺑소니"로 설명 될 수있다 같은 실험들은 사용 전에 중간 엽 줄기 세포를 활성화시킴으로써, 세포의 장기간 효과는보다 두드러 수있다. 지난 몇 년 동안, MSC의 타원체를 사용하는 중요한 기능 연구는 염증 반응을 억제하며 타원체를 준비하는 중간 엽 줄기 세포 (2)의 매력적인 양식을 대 식세포, 수지상 세포, 호중구 및 T 세포와 같은 효과기 세포 영향에 의해 생체 내에서 면역성을 조절할 수 있음을 입증 3. 또한, int와 같은 항암 분자의 제조erleukin-24 (IL-24) 및 종양 괴사 인자 관련 세포 사멸 유도 리간드 (TRAIL)는, 중간 엽 줄기 세포를 단일 층에 중간 엽 줄기 세포의 상대 3D 문화에 표적 암 치료 8, 10, 14 악용 될 수있는 현상을 증가한다.
기존의 MSC 문화 조직 배양 플라스틱뿐만 아니라 FBS의 사용뿐만 아니라 필요에 따라 임상 극복 할 수 있었다위한 또 다른 장애물은 MSC의 회전 타원체보다 의무 확인합니다. 이 장애물을 해결하기 위해 최근에 특정 화학적 XF 조건 MSC의 구 상체의 형성을 보였다 얻어진 MSC의 구 상체는 FBS (14)의 조건에서 발생되는 회전 타원체와 같은 항염증제 및 항암 성 분자를 생성하기 위해 활성화되었는지 세웠다. 여기서, 이러한 결과는 XF를 이용하여 3 차원 배양에 미리 활성화 된 중간 엽 줄기 세포의 생성을 보여주는 몇 가지 상세한 프로토콜에 제시미디어. 또한, 프로토콜은 함께 마우스에 그대로 타원체를 전달하는 실제적인 방법으로 그들의 항 염증, 면역 조절 및 항암 효과에 관해서는 상기 중간 엽 줄기 세포의 활성화 수준을 평가하기위한 효과적인 방법을 설명이 제시된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
일부 연구 및 임상 응용에 사용하기위한 최적의 MSC는 그들의 높은 이득을 최대화하기 위해 작동하고, 우선적으로 이러한 FBS 배지와 같은 이종 성분의 잠재적 인 항원의 전달을 최소화하기 위하여 화학적 XF 조건 하에서 제조한다. 여기에 설명 된 프로토콜에서, 우리는 1) 방법을 도시 한 타원체를 형성하여 3D 배양에서 중간 엽 줄기 세포를 활성화 2) XF 조건에서 중간 엽 줄기 세포의 3D 활성화를 달?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
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