Production et administration de la thérapeutique mésenchymateuses souches / cellules stromales (MSC) Spheroids apprêté dans les cultures 3-D dans des conditions d'Xeno-libres
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
cellules stromales souches / mésenchymateuses (CSM) sont très prometteurs en bioingénierie et la médecine régénérative. MSCs peuvent être isolés à partir de tissus adultes multiples par leur forte adhérence à la culture tissulaire en plastique, puis encore développés in vitro, le plus souvent à l' aide de sérum bovin fœtal (FBS). Depuis FBS peut provoquer des MSCs pour devenir immunogène, sa présence dans les cultures MSC limite les applications cliniques et expérimentales des cellules. (XF) médias libres xéno-Par conséquent, les études employant chimiquement définis pour les cultures MSC sont extrêmement précieux. De nombreux effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses ont été attribuées à leur capacité à réguler l'inflammation et l'immunité, principalement par la sécrétion de facteurs immunomodulateurs tels que le facteur stimulée par le gène de nécrose tumorale 6 (TSG6) et de la prostaglandine E2 (PGE2). Cependant, MSCs nécessitent une activation pour produire ces facteurs et puisque l'effet des cellules souches mésenchymateuses est souvent transitoire, un grand intérêt a émergé pour découvrir des moyens de pré-activation des cellules prior pour leur utilisation, ce qui élimine le temps de retard pour l' activation in vivo. Nous présentons ici des protocoles pour activer efficacement ou MSCs premiers en trois dimensions (3D) cultures dans des conditions XF définies chimiquement et d'administrer ces MSCs pré-activé in vivo. Plus précisément, nous décrivons d'abord les méthodes pour générer MSC sphérique micro-tissus ou «sphéroïdes» en gouttes suspendues à l'aide de moyen XF et démontrer comment les sphères et milieu conditionné (CM) peuvent être récoltées pour diverses applications. Deuxièmement, nous décrivons les écrans d'expression des gènes et in vitro des tests fonctionnels pour évaluer rapidement le niveau d'activation MSC en sphéroïdes, mettant l' accent sur le potentiel anti-inflammatoire et anti-cancer des cellules. En troisième lieu , on décrit une nouvelle méthode pour injecter des sphéroïdes intacts MSC dans le péritoine de souris pour tester in vivo l' efficacité. Dans l'ensemble, les protocoles ici à surmonter des défis majeurs de l'obtention de cellules souches mésenchymateuses pré-activé sous XF con défini chimiquementconditions et fournir un système flexible pour administrer sphéroïdes MSC pour les thérapies.
Introduction
Mésenchymateuses souches / cellules stromales (CSM) ont montré un grand potentiel pour diverses approches de la médecine régénératrice. MSC ont été initialement isolé en tant que composant de stroma de moelle osseuse , mais elles ont été obtenues à partir de nombreux autres tissus adultes, y compris le tissu adipeux 1, 2, 3. Fait intéressant, la méthode d'isolement principale englobe la propriété remarquable de cellules souches mésenchymateuses à adhérer étroitement sur une culture de tissu en plastique en présence de sérum de fœtus bovin (FBS). Bien que cette technique d'isolement classique permet une extension aisée et rapide des cellules souches mésenchymateuses en deux dimensions (2D) la culture, il est également très artificielle et ne tient pas compte l' importance de l'environnement naturel en trois dimensions (3D) conduisant à une perte potentielle d'importantes caractéristiques cellulaires 4, 5 , 6. Par conséquent, l'étude des cellules souches mésenchymateuses dans des cultures 3D, quisont plus physiologique que les cultures 2D traditionnels, a vu le jour à la recherche des caractéristiques de MSC "perdus / diminués». En outre, un grand intérêt a augmenté pour identifier les conditions (XF) gratuit xéno-chimiquement défini pour la culture et l'activation MSC, et donc rendre les cellules plus favorable pour les applications cliniques.
De nombreuses études ont été publiées démontrant la culture 3D de MSCs tant en biomatériaux et que des agrégats ou sphéroïdes sphériques. MSCs en biomatériaux ont été initialement conçus pour les approches d'ingénierie tissulaire pour remplacer des tissus endommagés par des échafaudages de cellules ensemencées, alors que les cultures sphéroïde de MSCs ont été considérés comme un moyen de comprendre le comportement de MSC in vivo après l' administration des cellules pour des thérapies dans les essais pré-cliniques ou cliniques 4, 5, 7. Fait intéressant, la forme MSCs sphéroïdes spontanément lorsque l'adhésion à la culture de tissus en plastique ne sont pas autorisés8, 9, 10. Traditionnellement, l'agrégation cellulaire a été facilitée par des procédés de ballon spinner ou des techniques d'incrustation liquides, les méthodes utilisées initialement dans la biologie du cancer dans les efforts visant à essayer d'imiter le microenvironnement tumoral. Plus récemment, d' autres méthodes sont apparues qui démontrent l' agrégation des cellules dans des boîtes de culture pré-enduit avec des produits chimiques spécifiques pour empêcher la cellule-plastique adhérence 4, 5, 6. L'un des plus simples et les plus économiques méthodes pour générer des sphéroïdes MSC est à la culture les en gouttes suspendues, une technique qui a été souvent utilisé pour produire des corps embryoïdes à partir de cellules souches embryonnaires. La pendaison technique de culture de goutte, l'adhérence des cellules à la matière plastique de culture de tissu est empêchée en mettant en suspension les cellules dans une goutte de milieu sur le côté inférieur d'un couvercle de boîte de culture tissulaire et en laissant la gravité pour faciliter AGGREG cellulairetion dans le sommet de la goutte. La taille des sphéroïdes peut être facilement manipulée en changeant la concentration des cellules ou du volume de la goutte, ce qui rend les cultures suspendues goutte particulièrement facile à contrôler.
Les premières études sur la culture 3D de MSCs ont démontré des différences radicales dans les caractéristiques des cellules en 3D par rapport à leurs homologues 2D 6, 8, 9. Dans le même temps, des rapports ont démontré que les effets bénéfiques des cellules souches mésenchymateuses in vivo comptaient sur leur capacité à devenir activés par des signaux micro-environnementales et, en réponse, pour produire des anti-inflammatoires et immunomodulateurs 11 facteurs. Fait intéressant, la plupart de ces facteurs, tels que la Prostaglandine E2 (PGE2), d'une tumeur gène du facteur stimulée nécrose 6 (TSG6) et le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) ont été produits en quantités beaucoup plus importantes de sphéroïdes MSC que MSCs 2D traditionnels ouvrant la voie à la idée deen utilisant des cultures 3D pour activer les cellules 8, 12, 13. De plus, l' activation de gènes dans des cultures 3D est apparu récapituler les mécanismes, au moins en partie, de l' activation des cellules après injection à des souris 12. En activant MSCs avant leur utilisation dans des expériences, les effets des cellules peuvent être longs et plus important que l'effet de MSC traditionnelle in vivo est souvent retardé et transitoire, et peut être décrit comme "hit and run". Au cours des dernières années, des études fonctionnelles importantes en utilisant sphéroïdes MSC ont démontré qu'ils peuvent supprimer les réponses inflammatoires et de moduler l' immunité in vivo en influençant les cellules effectrices telles que les macrophages, les cellules dendritiques, les neutrophiles et les cellules T faisant sphéroïdes une forme attrayante de MSCs apprêtées 2 , 3. En outre, la production de molécules anticancéreuses, telles que interleukin-24 (IL-24) et la nécrose de la tumeur lié au facteur de ligand induisant l' apoptose (TRAIL) sont augmentés dans des cultures 3D de cellules souches mésenchymateuses par rapport à la monocouche MSCs, un phénomène qui pourrait être exploité pour la thérapie ciblée des cancers 8, 10, 14.
Comme la culture de MSC traditionnelle exigeait non seulement l'utilisation de la culture de tissus en plastique, mais aussi FBS, un autre obstacle pour rendre sphéroïdes MSC plus favorable pour une utilisation clinique avait à surmonter. Pour faire face à cet obstacle, nous avons récemment montré la formation de sphéroïdes MSC dans des conditions de XF spécifiques définis chimiquement et établi que les sphéroïdes MSC résultants ont été activés pour produire les mêmes molécules anti-inflammatoires et anti-cancéreuses que les sphéroïdes générés dans des conditions avec du FBS 14. Ici, ces résultats sont présentés dans plusieurs protocoles détaillés qui démontrent la génération de cellules souches mésenchymateuses pré-activé dans les cultures 3D en utilisant XFmédias. En outre, les protocoles sont présentés qui décrivent des moyens efficaces pour évaluer les niveaux des MSCs d'activation en ce qui concerne leurs effets anti-inflammatoires, immunomodulatrices et anti-cancéreuses, ainsi qu'un procédé pratique pour livrer les sphéroïdes intacts dans des souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le MSC optimal pour une utilisation dans des applications cliniques et de recherche devrait être très active pour maximiser leur profit, et préférentiellement préparé dans des conditions XF chimiquement définis pour réduire au minimum la fourniture d'antigènes potentiels de moyenne composants xénogéniques tels que FBS. Dans les protocoles décrits ici, nous avons montré des méthodes pour 1) activer MSCs en culture en 3D par la formation de sphéroïdes, 2) réaliser l'activation 3D des cellules souc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
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