Elettroporazione in utero approcci per studiare l'eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell
Summary
Questo manoscritto fornisce protocolli che utilizzano in utero elettroporazione (IUE) per descrivere la connettività strutturale dei neuroni a livello di singola cellula e l'eccitabilità dei neuroni fluorescente. Istologia è utilizzato per caratterizzare dendritiche e le proiezioni assonali. registrazione a cellula intera a fette acuta viene utilizzato per studiare l'eccitabilità.
Abstract
Il sistema nervoso è composto da una vasta gamma di tipi neuronali distinti. Queste sottopopolazioni neuronali sono caratterizzati da, tra le altre caratteristiche, le loro morfologie dendritiche distinti, i loro modelli specifici di connettività assonale, e le loro risposte di cottura selettive. I meccanismi molecolari e cellulari responsabili di questi aspetti di differenziazione durante lo sviluppo sono ancora poco conosciuti.
Qui, descriviamo protocolli combinati per l'etichettatura e caratterizzare la connettività strutturale e l'eccitabilità dei neuroni corticali. Modifica del protocollo di elettroporazione in utero (IUE) consente l'etichettatura di una popolazione sparsa di neuroni. Questo, a sua volta, consente l'identificazione e la manutenzione dei dendriti e assoni dei singoli neuroni, la precisa caratterizzazione della posizione laminare di proiezioni assonale e analisi morfometrica. IUE può anche essere usato per studiare variazioni l'eccitabilitàwild-type (WT) o neuroni geneticamente modificati attraverso la combinazione con la registrazione a cellula intera da fettine acute di cervelli elettroporate. Queste due tecniche contribuiscono ad una migliore comprensione dell'accoppiamento di connettività strutturale e funzionale dei meccanismi molecolari che controllano diversità neuronale durante lo sviluppo. Questi processi di sviluppo hanno importanti implicazioni sul cablaggio assonale, la diversità funzionale dei neuroni, e la biologia dei disturbi cognitivi.
Introduction
Lo sviluppo di strutture dendritiche e assonale è un aspetto importante della regolazione circuito nel sistema nervoso, compreso nella corteccia cerebrale. Essa svolge un ruolo critico durante il cablaggio selettivo delle diverse sottopopolazioni neuronali. Un certo numero di rapporti recenti hanno dimostrato che, oltre alla connettività, la diversità molecolare dei neuroni è riflessa dalla acquisizione di modalità altamente specifiche di cottura. Tuttavia, i meccanismi che determinano l'eccitabilità e la connettività dei sottotipi neuronali distinti durante lo sviluppo, così come il loro grado di coordinamento, sono ancora poco conosciuti 1, 2.
In vivo in perdita e guadagno di funzione analizza consentire lo studio del rapporto tra il livello di espressione di geni specifici e la loro influenza nello sviluppo del circuito. In utero elettroporazione (IUE) è una tecnica ampiamente utilizzata per lo studiola funzione di un gene di interesse in specifiche popolazioni neuronali e studiare gli schemi generali della loro connettività. Tuttavia, per determinare le caratteristiche morfologiche degli assoni e dendriti in strati corticali in topi vivi, è essenziale per etichettare i neuroni scarsamente. Un sistema di ricombinazione Cre combinato con IUE può essere usato per marcare una scarsa popolazione di neuroni in una sufficientemente bassa densità per risolvere le proiezioni emessi dalle singole celle delle lamine corticali identificati. Questo metodo etichetta un numero sufficiente di neuroni per corteccia di ottenere dati quantitativi dopo l'analisi dei numeri ragionevoli di cervelli elettroporate (Figura 1). Questo manoscritto presenta un metodo per tale analisi multa di connettività. Presenta inoltre una strategia simile per l'analisi, in esperimenti separati, le proprietà elettriche dei neuroni eseguendo registrazioni current-clamp su verde proteina fluorescente (GFP) -electroporated cellule da fette corticali acute. questi protocoli sono versatili e possono essere applicati allo studio dell'eccitabilità e la connettività dei neuroni di animali WT e transgenici, e anche di neuroni in cui perdite e guadagni di funzione vengono introdotti da plasmidi addizionali durante IUE.
Sebbene questo protocollo descrive l'elettroporazione di topi a giorno embrionale (E) 15.5, questa tecnica può essere eseguita a qualsiasi età tra E9.5 3 al giorno postnatale (P) 2 4. Mentre elettroporazione nelle fasi iniziali si rivolge neuroni e precursori del talamo e strati profondi della corteccia, i marchi di elettroporazione in seguito allo stadio strati più superficiali (ad esempio, neuroni E15.5 IUE obiettivi strato II-III). In sintesi, la combinazione di IUE con l'analisi morfologica singola cellula ed elettrofisiologia è uno strumento utile per chiarire i meccanismi molecolari alla base della enorme diversità strutturale e funzionale dei neuroni nel sistema nervoso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive in dettaglio come etichettare i neuroni della corteccia somatosensoriale di C75BL / 6 topi al fine di analizzare la loro connettività e la loro eccitabilità. Rispetto ai metodi esistenti, visualizza aspetti discriminanti connettività, come il numero di rami assonali per neurone, la loro precisa topografia, e la loro posizione anatomica. Modificando la posizione degli elettrodi, è possibile indirizzare altre popolazioni neuronali, come la corteccia del cingolo (mantenere lo stesso angolo tr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a R. Gutiérrez e A. Morales per la loro eccellente assistenza tecnica e di LA Weiss per la modifica. CGB è finanziato dagli spagnoli Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione da BBVA Foundation e SAF2014-58598-jin (MINECO) a M. Navarrete e da una sovvenzione della Fondazione Areces e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-REDT (da MINECO) a Ramon M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
