자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근
Summary
이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.
Abstract
신경계의 연결은 별개 형태의 엄청난 범위로 구성된다. 이러한 신경 세포의 소집단 다른 기능, 자신의 고유 한 수지상 형태학, 축삭 연결의 특정 패턴과 선택적 발사 응답 중 특징으로한다. 개발하는 동안 차별화의 이러한 측면을 담당하는 분자 및 세포 메커니즘은 여전히 저조한 이해된다.
여기, 우리는 라벨에 대한 결합 된 프로토콜을 설명하고 대뇌 피질의 신경 세포의 구조적 연결과 흥분을 특성화. 에서 자궁 전기 (IUE) 프로토콜의 수정은 뉴런의 스파 스 인구의 표시를 할 수 있습니다. 이것은, 차례로, 개별 돌기 신경 축색 돌기 층류 위치의 정확한 특성 및 형태 계측 학적 분석 축삭의 식별 및 추적 할 수있다. IUE 또한 흥분성의 변화를 조사하기 위하여 사용될 수있다야생형 (WT) 또는 전기 천공 두뇌의 급성 조각에서 전체 셀 녹음과 결합하여 유전자 변형 뉴런. 이 두 기술은 구조적 및 기능적 연결성의 결합에 대한 이해 및 개발 중에 신경 다이버 시티를 제어하는 분자 메커니즘에 기여한다. 이러한 발달 과정은 축삭 배선, 신경 세포의 기능 다양성,인지 장애의 생물학에 중요한 의미를 가지고있다.
Introduction
수지상 및 축삭 구조의 개발은 대뇌 피질에서 비롯한 신경계의 조절 회로의 중요한면이다. 또한 다양한 신경 세포 개체군의 선택 배선 동안 중요한 역할을한다. 최근 보고서 다수 연결 이외에 뉴런의 분자 다양성 소성 높은 특정 모드의 획득에 의해 반사되고, 그 보였다. 그러나, 개발 중에 별개 아형 신경의 흥분성 연결성 결정 메커니즘뿐만 아니라 배위 학위 여전히 잘못 2 1 이해된다.
생체 loss- 및 기능 획득하는 발현 유전자의 특정 레벨과 상기 회로의 개발에 대한 영향 사이의 관계에 대한 연구를 허용 분석한다. 자궁의 전기에서 (IUE)는 광범위하게 연구하는 데 사용하는 기술입니다특정 신경 인구에 대한 관심의 유전자의 기능과는 연결의 전체 패턴을 연구합니다. 그러나, 살아있는 생쥐의 대뇌 피질 층의 축삭과 수상 돌기의 형태 학적 특성을 결정하기 위해서는 띄엄 띄엄 뉴런 레이블을하는 것이 필수적이다. IUE와 결합 Cre 호텔 재조합 시스템은 식별 된 피질 박편의 개별 셀에 의해 방사 돌기를 해결하기 위해 충분히 낮은 밀도 뉴런 저밀도 인구를 표시하는데 사용될 수있다. 이 방법은 전기 천공 뇌 (도 1)의 적절한 수의 정량적 분석 후 데이터를 획득 피질 뉴런 당 충분한 수의 라벨. 이 원고는 연결의 미세 분석을위한 방법을 제시한다. 또한 별도의 실험에서, 분석과 유사한 전략을 제공, 녹색 형광 단백질 (GFP)에 전류 클램프 기록을 수행함으로써 신경 세포의 전기적 특성은 급성 대뇌 피질의 조각에서 세포 -electroporated. 이 프로tocols는 손실 함수의 게인이 IUE 동안 추가 플라스미드 도입 된 뉴런과 같은 다목적 및 WT 형질 전환 동물의 신경 세포의 흥분성 연결성 연구에 적용 할 수 있으며.
이 프로토콜은 배아 일 (E) 15.5에서 마우스의 전기를 설명하지만,이 기술은 E9.5 3 및 출생 후의 일 (P)이 4 사이의 나이에 수행 할 수 있습니다. 초기 단계에서 전기는 신경 세포와 시상의 전구체와 피질의 깊은 층, 이후 단계 전기 마크보다 표면 층 (예를 들어, E15.5 IUE 목표 층 II-III 뉴런)를 대상으로하지만. 요약하면, 단일 셀 형태 학적 분석과 함께 전기 생리학 IUE의 조합 신경계 뉴런의 엄청난 구조적 및 기능적 다양성의 기초가되는 분자 메카니즘을 해명하는 유용한 도구이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 연결과 흥분을 분석하기 위해 C75BL / 6 마우스의 체성 감각 피질의 뉴런 레이블을하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 기존의 방법과 관련하여, 이러한 신경 세포 축삭 당 분기의 수, 정확한 지형 및 해부학 적 위치로 연결성 판별 측면을 가시화. 전극의 위치를 변경함으로써, 예에 cingulate 피질과 같은 다른 신경 세포 집단을 대상 (전극 뇌와 같은 각도를 유지하지만, 자극의 방향 변…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 우수한 기술 지원 및 편집을위한 LA 바이스에 R. 구티에레스와 A. 모랄레스에 감사하고 있습니다. CGB는 스페인 Ministerio 드 Ciencia 전자 Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011에 의해 투자된다. 이 작품은 M. Navarrete은에 BBVA 재단과 SAF2014-58598-JIN (MINECO)에서 연구비와 라몬 Areces 재단과 보조금 SAF2014-52119-R과 (MINECO에서) BFU2014-55738 – REDT에에서 보조금에 의해 투자되었다 M. 니에 토.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
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