I Utero Electroporation Tilnærminger til Studer Excitability av neuronal subpopulasjoner og Single-celle Tilkobling
Summary
Dette manuskriptet gir protokoller som bruker i utero electroporation (IUE) for å beskrive strukturelle tilkobling av nerveceller ved encellede nivå og oppstemthet av fluorescensmerkede nevroner. Histologi brukes til å karakterisere dendrittiske og aksonal anslag. Hel-celle-opptak i akutte skiver blir brukt til å undersøke eksitabilitet.
Abstract
Nervesystemet er sammensatt av et enormt utvalg av forskjellige neuronale typer. Disse nerve subpopulasjoner kjennetegnes av blant andre funksjoner, deres distinkte dendrittiske morfologi, deres spesifikke mønstre av aksonal tilkobling, og deres selektive skyte svar. De molekylære og cellulære mekanismene som er ansvarlig for disse sidene ved differensiering under utvikling er fortsatt dårlig forstått.
Her beskriver vi kombinerte protokoller for merking og karakterisere den strukturelle tilkobling og oppstemthet av kortikale nevroner. Endring av i utero electroporation (IUE) protokollen tillater merking av en glissen befolkning av nerveceller. Dette i sin tur gjør det mulig for identifisering og sporing av dendritter og aksoner av individuelle nevroner, den presise karakteriseringen av den laminære plasseringen av aksonale projeksjoner, og morfometrisk analyse. Iue kan også brukes til å undersøke forandringer i eksitabilitet avvilltype (WT) eller genmodifiserte nevroner ved å kombinere den med hel-celle opptak fra akutte skiver av electroporated hjerne. Disse to teknikker for å bidra til en bedre forståelse av koplingen av strukturell og funksjonell tilkobling og av de molekylære mekanismer som kontrollerer neuronal mangfold under utvikling. Disse utviklingsprosesser har viktige implikasjoner på aksonal ledninger, den funksjonelle mangfold av nerveceller, og biologi kognitive forstyrrelser.
Introduction
Utviklingen av dendrittiske strukturer og aksonal er en viktig del av kretsen regulering i nervesystemet, inkludert i hjernebarken. Det spiller en avgjørende rolle under den selektive kabling av de ulike nevrale delpopulasjoner. En rekke nyere rapporter har vist at i tillegg til tilkobling, blir den molekylære mangfoldet av nerveceller som reflekteres ved anskaffelse av svært spesifikke modi for avfyring. Imidlertid er de mekanismene som bestemmer oppstemthet og tilkobling av forskjellige nevrale subtyper under utvikling, samt deres grad av koordinering, fortsatt dårlig forstått ett, to.
In vivo taps og gain-of-funksjonsanalyser gir mulighet for å studere forholdet mellom ekspresjonsnivået av spesifikke gener og deres innflytelse på utviklingen av kretsen. I utero electroporation (IUE) er en teknikk mye brukt til å studerefunksjonen av et gen av interesse i spesifikke nevronale populasjoner og for å studere de samlede mønstre av sin tilkobling. Imidlertid, for å bestemme de morfologiske egenskapene av aksoner og dendritter i kortikale lag i levende mus, er det viktig å merke neuroner tynt. Et Cre rekombinasjon system kombinert med iue kan brukes til å markere en sparsom populasjon av nerveceller ved en tilstrekkelig lav tetthet til å løse fremspringene som sendes ut fra de enkelte celler av de identifiserte kortikale lamellene. Denne metoden etiketter et tilstrekkelig antall neuroner pr cortex for å oppnå kvantitative data etter analyse av rimelige mengder elektroporerte hjerne (figur 1). Dette manuskriptet presenterer en metode for slike fine analyse av tilkoblingsmuligheter. Den presenterer også en lignende strategi for å analysere, i egne eksperimenter, de elektriske egenskapene av nerveceller ved å utføre dagens-clamp opptak på grønn fluorescens protein (GFP) -electroporated celler fra akutte cortical skiver. disse protokoler er allsidig og kan anvendes i studiet av eksitabilitet og tilkobling av neuroner av WT og transgene dyr, og også av neuroner i hvilken tap og gevinster av funksjon er innført av ytterligere plasmider under iue.
Selv om denne protokollen beskriver electroporation av mus ved embryonale dag (E) 15.5, kan denne teknikken utføres når som helst alder mellom E9.5 tre og postnatal dag (P) 2 4. Mens electroporation på tidlige stadier rettet nevroner og forløpere til thalamus og dype lag av hjernebarken, senere stadium electroporation merkene mer overflatiske lag (f.eks E15.5 IUE mål lag II-III nevroner). I sammendrag, er kombinasjonen av iue med enkelt-celle morfologisk analyse og elektrofysiologi er et nyttig verktøy for å belyse de molekylære mekanismer som ligger til grunn for den enorme strukturell og funksjonell diversitet av neuroner i nervesystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du merke nevroner av somatosensoriske cortex av C75BL / 6 mus for å analysere sine tilkoblingsmuligheter og deres oppstemthet. Med hensyn til eksisterende metoder, synliggjør det diskriminerende aspekter ved tilkobling, slik som antallet aksonal grener pr neuron, deres presise topografi, og deres anatomisk lokalisering. Ved å endre posisjonen av elektrodene, er det mulig å målrette andre nervepopulasjoner, som cingulate cortex (beholde den samme vinkel mellom elektrodene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for R. Gutiérrez og A. Morales for deres utmerkede teknisk assistanse og til LA Weiss for redigering. CN er finansiert av den spanske Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra BBVA Foundation og SAF2014-58598-JIN (MINECO) til M. Navarrete og ved en bevilgning fra Ramón Areces Foundation og tilskudd SAF2014-52119-R og BFU2014-55738-REDT (fra MINECO) til M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
