I livmodern elektroporering Approaches att studera retbarhet av neuronala Subpopulationer och encelliga Connectivity
Summary
Detta manuskript ger protokoll som använder i livmodern elektroporering (IUE) för att beskriva den strukturella anslutning av nervceller vid encelliga nivå och retbarhet av fluorescerande nervceller. Histologi används för att karakterisera dendritiska och axonal prognoser. Hela-cell inspelning i akuta skivor används för att undersöka retbarhet.
Abstract
Nervsystemet består av ett enormt utbud av olika neuronala typer. Dessa neuronala subpopulationer kännetecknas av, bland andra funktioner, deras distinkta dendritiska morfologier, deras specifika mönster av axonal anslutning, och deras selektiva skjut svar. De molekylära och cellulära mekanismer som är ansvariga för dessa aspekter av differentiering under utveckling fortfarande dåligt kända.
Här beskriver vi kombinerade protokoll för märkning och karakterisera den strukturella anslutningsmöjligheter och retbarhet kortikala neuroner. Ändring av protokollet i livmodern elektroporering (IUE) kan märkningen av en gles befolkning av nervceller. Detta i sin tur gör det möjligt att identifiering och spårning av dendriter och axoner av enskilda nervceller, exakt karakterisering av den laminära lokaliseringen av axonal prognoser och morfometrisk analys. IUE kan också användas för att undersöka förändringar i retbarhet avvild-typ (WT) eller genetiskt modifierade nervceller genom att kombinera den med helcells-inspelning från akut skivor electroporated hjärnor. Dessa två tekniker bidra till en bättre förståelse för kopplingen av strukturell och funktionell uppkoppling och av de molekylära mekanismer som styr neuronal mångfald under utveckling. Dessa utvecklingsprocesser har viktiga konsekvenser för axonal ledningar, den funktionella mångfalden av nervceller, och biologi kognitiva störningar.
Introduction
Utvecklingen av dendritiska och axonal strukturer är en viktig aspekt av kretsreglering i nervsystemet, bland annat i hjärnbarken. Den spelar en avgörande roll under den selektiva ledningar av de olika neuronala subpopulationer. Ett antal nya rapporter har visat att förutom anslutning, är den molekylära mångfalden av nervceller som reflekteras av förvärvet av mycket specifika typer av bränning. Men de mekanismer som bestämmer retbarhet och anslutning av de distinkta neuronala subtyper under utveckling, liksom deras grad av samordning, fortfarande dåligt kända 1, 2.
In vivo förlust- och få-av-funktion analyser möjliggör studier av förhållandet mellan uttrycksnivån av specifika gener och deras inflytande i utvecklingen av kretsen. I livmodern elektroporering (IUE) är en teknik som används i stor utsträckning för att studerafunktionen av en gen av intresse i specifika neuronala populationer och att studera de övergripande mönster av deras anslutning. Men för att bestämma morfologiska egenskaperna hos axoner och dendriter i kortikala skikt i levande möss, är det viktigt att märka nervceller glest. En Cre rekombination kombinerat med IUE kan användas för att markera en gles befolkning av nervceller vid en tillräckligt låg densitet för att lösa de prognoser som avges av enskilda celler i de identifierade kortikala lamellerna. Denna metod etiketter ett tillräckligt antal neuroner per cortex att få kvantitativa data efter analys av rimliga mängder electroporated hjärnor (Figur 1). Detta manuskript presenterar en metod för sådan fin analys av anslutning. Den presenterar också en liknande strategi för att analysera, i separata experiment, de elektriska egenskaperna hos nervceller genom att utföra strömkläm inspelningar på grönt fluorescerande protein (GFP) -electroporated celler från akut kortikala skivor. dessa protokoler är mångsidiga och kan användas för att studera i retbarhet och anslutning av neuroner i WT och transgena djur, och även neuroner där vinster och förluster på funktion införs genom ytterligare plasmider under IUE.
Även om detta protokoll beskriver elektroporering av möss vid embryonal dag (E) 15,5, kan denna teknik utföras vid alla åldrar mellan E9.5 3 och postnatal dag (P) 2 4. Medan elektroporering i tidiga skeden riktar neuroner och förstadier i thalamus och djupa lagren av hjärnbarken, senare skede elektroporation märken mer ytliga skikt (t.ex. E15.5 IUE mål skikt II-III neuroner). Sammanfattningsvis är kombinationen av IUE med encelliga morfologisk analys och elektro ett användbart verktyg för att klarlägga de molekylära mekanismerna bakom den enorma strukturella och funktionella mångfald av nervceller i nervsystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver i detalj hur man märka neuroner i somatosensoriska cortex av C75BL / 6-möss för att analysera deras anslutning och deras retbarhet. När det gäller befintliga metoder, visualiserar det diskriminerande aspekter av anslutningsmöjligheter, till exempel antalet axonal förgreningar per neuron, deras exakta topografi, och deras anatomiska läge. Genom att ändra placeringen av elektroderna, är det möjligt att rikta andra neuron populationer, såsom cingulatecortexen (behålla samma vinkel mel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för R. Gutiérrez och A. Morales för deras utmärkta tekniskt bistånd och till LA Weiss för redigering. CGB finansieras av den spanska Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från BBVA Foundation och SAF2014-58598-JIN (Mineco) M. Navarrete och genom ett bidrag från Ramón Areces Foundation och bidrag SAF2014-52119-R och BFU2014-55738-REDT (från Mineco) till M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
