Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Summary

Mitokondrier kan utnytte det elektrokjemiske potensial over sin indre membran (Δ _Ψm) binder kalsium (Ca2 ^+), slik at de kan forme cytosolisk Ca2 ⁺ signalering i cellen. Vi beskriver en metode for samtidig måling mitokondrier Ca ²⁺ opptak og ΔΨ _M i levende celler ved hjelp av fluorescerende fargestoffer og konfokal mikroskopi.

Abstract

Bortsett fra sin avgjørende rolle i å generere ATP, mitokondrier også fungere som lokale kalsium (Ca ²⁺⁾ buffere til tett regulere intracellulær Ca ²⁺ konsentrasjon. For å gjøre dette, mitokondrier utnytte elektrokjemiske potensial på tvers av deres indre membran (ΔΨ _m) for å beslaglegge Ca ^2+. Tilstrømningen av Ca2 ⁺ inn i mitokondriene stimulerer tre hastighetsbegrensende dehydrogenaser i sitronsyresyklusen, og øker elektronoverføring gjennom oksidativ fosforylering (OXPHOS) komplekser. Denne stimuleringen opprettholder ΔΨ _m, som er midlertidig bort så de positive kalsiumioner krysse den mitokondrielle indre membran inn i den mitokondrielle matriks.

Vi beskriver her en metode for samtidig måling mitokondrier Ca ²⁺ opptak og ΔΨ _M i levende celler ved hjelp av konfokal mikroskopi. Ved permeabilizing cellene, mitokondrielle Ca ²⁺ muligmåles ved hjelp av det fluorescerende Ca ²⁺ indikator Fluo-4, AM, med måling av ΔΨ _m ved bruk av det fluorescerende fargestoff tetramethylrhodamine, metylester, perklorat (TMRM). Fordelen med dette systemet er at det er svært lite spektral overlapping mellom de fluoriserende fargestoffer, slik at nøyaktig måling av mitokondriell Ca ²⁺ og ΔΨ _m samtidig. Ved hjelp av sekvensiell tilsetning av Ca ^{2 +} aliquoter, mitokondrielle Ca ²⁺ opptak kan overvåkes, og den konsentrasjon ved hvilken Ca2 ⁺ induserer mitokondriemembranen permeabilitet overgang og tap av ΔΨ _m bestemmes.

Introduction

Mitokondrier spiller en viktig rolle i regulering av intracellulær Ca2 ⁺ konsentrasjon ved å virke som lokale Ca ^{2 + 1} buffere. Ca ^{2 +} kommer inn i mitokondriene via Ca2 ⁺ uniporter, en prosess som drives av den elektrokjemisk gradient som eksisterer på tvers av mitokondrie indre membran (ΔΨ _m) ^2. Inne mitokondrielle matriks, kan Ca ²⁺ aktivere oksidativ fosforylering ved å stimulere tre hastighetsbegrensende dehydrogenaser i sitronsyresyklusen ^tre. Denne stimuleringen opprettholder ΔΨ _m, som er midlertidig bort så de positive kalsiumioner krysse den mitokondrielle indre membran inn i den mitokondrielle matriks. Dersom Ca2 ⁺ konsentrasjonen i mitokondriene blir meget høy, kan mitokondriell permeabilitet overgang initieres, noe som resulterer i spredning av ΔΨ _m, den cessation av oksidativ fosforylering og induksjon av celledød signalveier ^4.

Den viktige rollen som mitokondriene spiller i den romlige bufring av mobilnettet kalsium gjør nøyaktig overvåking av mitokondriell kalsium kritisk. Det er etablert forskjellige fremgangsmåter for å overvåke mitokondrie kalsium, herunder bruk av rhodamin baserte fargestoffer. En slik fargestoff, Rhod-2, AM, er ganske effektiv på partisjone til mitokondriene for å måle mitokondrielle Ca ²⁺ nivåer ^{5, 6.} Det må imidlertid bli brukt som noen fargestoff vil samle seg i andre organeller, så som liposomer, eller forbli i cellen cytosol. Ikke desto mindre kan nedstrøms analyser anvendes for å skille disse signaler fra de fra mitokondrier ^7.

En annen teknikk for å overvåke mitokondrie kalsium benytter fluorescerende reporter konstruerer ⁸ </s opp>. Nytten av disse genetisk kodede sonder er at de kan bli spesifikt rettet mot mitokondriene ved hjelp av endogene N-terminale peptider, for eksempel de N-terminale målretting signal av humant COX subenhet VIII. Dette systemet har blitt anvendt for å generere en mitokondrie-målrettet aequorin sonde som har vist seg å være svært nyttig for undersøkelse av mitokondrielle kalsiumsignalering ^9. Den største ulempen med disse genetisk kodede sonder er at de trenger å bli introdusert inn i cellene ved transient ekspresjon (som ikke er mulig for visse celletyper, og kan gi varierende resultater), eller ved å opprette stabile ekspresjonssystemer (som er tidkrevende).

For å omgå problemene skissert ovenfor, har vi utviklet en ny protokoll for å måle mitokondrielle Ca ²⁺ og ΔΨ _m samtidig. Denne protokollen er basert på en tidligere beskrevet metode som legger eksogene kalsium til permeabiliserte cellenes = "xref"> 10. Vår protokollen har tre fordeler fremfor andre metoder: For det første bruker vi Fluo-4, AM og TMRM å overvåke mitokondrielle Ca ²⁺ og ΔΨ _m, to fargestoffer som har svært forskjellige spektrale egenskaper; for det andre, blir cellene permeabilisert slik at Fluo-4 signalet bare å detektere mitokondrie Ca ²⁺ og ikke Ca ²⁺ lokalisert til andre organeller eller cellen cytosolen; og for det tredje, bruk av Fluo-4 for å påvise mitokondrie Ca ²⁺ muliggjør rask og enkel cellefarging, benektende noen celle transfeksjonsteknologier eller transformasjons problemer som finnes ved bruk av genetisk kodet sonder.

Protocol

1. Utarbeidelse av celler Dyrke cellene på 10 cm cellekulturskåler eller 75 cm2 kolber i kulturmedium [10 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 5% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1 x penicillin / streptomycin (P / S )] ved 37 ° C / 5% CO2. Å høste celler, fjerner media ved aspirasjon, vask deretter med 5 ml 1x fosfatbufret saltvann (1x PBS). Fjern 1 x PBS ved aspirasjon, og deretter legge til 1,5 ml 0,25% (vekt / volum) trypsin / 0,25% (w / v) et…

Representative Results

Vi har brukt denne protokollen for å undersøke effekten av en MT-ND5 mutasjon på evnen til 143B celle mitokondriene til buffer øker i kalsium 12. I det eksempel som er vist her, ble kontroll-143B-celler lastet med TMRM og Fluo-4 AM før permeabiliseringen med digitonin. Etter 5 min av avbildning, åtte sekvensielle tilsetninger av en 1: 100 fortynning ble 40 mM CaCl2 eksogene laget, med den endelige frie Ca2 + ion-konsentrasjon […

Discussion

Kalsium spiller en avgjørende rolle i mange celleprosesser, inkludert muskel sammentrekning, neuronal signalering og celleproliferasjon ^13. Økning i celle kalsiumkonsentrasjoner er ofte forbundet med energietterspørsel, med kalsium i stand til å direkte stimulere mitokondrie oksidativ fosforylering å øke ATP generasjon ^tre. Det er derfor viktig at vi har muligheten til å effektivt overvåke mitokondrie kalsium akkumulering og å kunne sammenligne hvordan denne funks…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641