Summary
Her præsenterer vi en protokol til billedet celler, der udtrykker grønt fluorescerende protein-mærket angiotensin typen 1a-receptorer under endocytose igangsat af angiotensin II-behandling. Denne teknik omfatter mærkning lysosomer med et andet fluorescerende markør, og derefter anvender software til at analysere co-lokalisering af receptor og lysosomer i tre dimensioner over tid.
Abstract
Live-cell imaging bruges til samtidig at indfange time-lapse billeder af angiotensin typen 1a-receptorer (AT 1a R) og intracellulære rum i transfekterede humane embryonale nyre-293 (HEK) celler efter stimulation med angiotensin II (Ang II). HEK-celler transient transficeret med plasmid DNA indeholdende AT 1a R tagget med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Lysosomer er identificeret med et rødt fluorescerende farvestof. Levende-celle bliver optaget på en laser konfokalt efter Ang II stimulering og analyseret ved software i tre dimensioner (3D, voxels) over tid. Live-cell imaging giver undersøgelser receptor menneskehandel og undgår andre variable forbundet med fiksering, og især tab eller kulturgenstandsspor fortrængning af EGFP-mærkede membranreceptorer. Således som individuelle celler spores gennem tiden, den subcellulære lokalisering af receptorer kan afbildes og måles. Billeder skal erhverves sufficiently hurtigt at indfange hurtige vesikel bevægelse. Men ved hurtigere billeddannelse hastigheder, er antallet af fotoner indsamlede reduceret. Kompromiser skal også gøres i udvælgelsen af imaging parametre som voxel størrelse for at få billeddannelseshastighed. Væsentlige anvendelser af live-cell imaging er at studere protein trafficking, migration, proliferation, cellecyklus, apoptose, autofagi og protein-protein-interaktion og dynamik, for blot at nævne nogle få.
Introduction
Det overordnede mål er at få kvantitative beviser i tid og rum af receptor colokalisering med specifikke subcellulære organeller efter behandling med en receptor agonist. Således umiddelbare mål her er at fange time-lapse konfokale billeder af lysosomer og en transmembranomspændende receptor i humane embryoniske nyreceller (HEK) efter transfektion og efterfølgende at samle og analysere billeddata i 3D til kvantitativ måling levering af receptoren til lysosomer. Undersøgelse samtidig handel med en transmembrane receptor med lysosomer eller andre organeller under endocytose når det aktiveres af receptor ligand kan hjælpe med at bestemme, hvordan den transmembrane receptor reguleres under fysiologiske og patofysiologiske forhold.
AT 1a R formodes at blive nedbrudt i lysosomer efter behandling med Ang II i modelsystemer celler systemer, primært HEK293 1 selvom størstedelen af receptors primært lokaliseret i multivesikulære genanvendelse endosomer til senere genanvendelse til plasmamembranen, mens størstedelen af liganden, Ang II, nedbrydes i lysosomer 2, 3, 4, 5. For nylig Li et al. påvist under anvendelse Forster-resonansenergioverførsel (FRET) og fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) teknikker, AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm skala) med LAMP1, et lysosomalt membranprotein antyder, at i det mindste nogle af receptoren er målrettet til og nedbrudt af lysosomer 6. Disse forfattere bemærkede, at lysosomale inhibitor chloroquin blokeret AT 1a R-LAMP1 forening, der er i overensstemmelse med tidligere rapporter tyder på, at en effekt af chloroquin er at blokere fusion af sene endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andre indirekte metoder til at bestemme AT 1a R localization i lysosomer har udnyttet bafilomycin, en lysosomal inhibitor at udlede AT 1a R tilstedeværelse i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live-cell imaging undgår potentielle virkninger af fiksering på celle volumen, og tab / dæmpning / omfordeling af GFP-kimære receptor. Tidligere undersøgelser har påberåbt fikserede celler til bestemmelse colokalisering eller samtidig forekomst af receptoren med lysosomer eller brug af levende celler mærket med receptorbindende surrogater, såsom β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging af andre GPCR'er ved hjælp roterende skive konfokal eller laser punkt scanning confocal mikroskoper udstyret med Gaasp eller Hyd detektorer aktiveret efterforskere at observere internalisering af og handel med receptorer i de enkelte celler afbildet i z-stakke med 30 s intervaller 9, 10. Men selv når levende celle z-stakke hurtigt opsamles, kan analysen kun ske efter valget af en enkelt plan inden for hver stak, dvs. i 2D 10. Mens dette kan være tilstrækkelig til at studere internaliseret GPCR eller tyrosinkinasereceptor pågældende, AT-1a Rs akkumuleres i vesikler, der ændrer størrelse og placering over tid og er således ifølge sagens natur mere vanskeligt i tilstrækkelig grad prøve under anvendelse af en repræsentativ enkelt skive på hvert tidspunkt. At grundigt fastlægge, hvilken rute af det mærkede AT 1a R gennem cellen og til at opdage hver delpopulation af vesikler forskellige i størrelse og placering, har vi udviklet en metode til 3D-billeder og 3D-analyse for at spore disse ændringer, og at være anvendes i forbindelse med mærkning af forskellige intracellulære rum såsom lysosomer.
Efterforskere kan bruge denne protokol for live-cell imaging til direkte visualisere bevægelse AT 1a R ind i cellen og dens overførsel til subcellulære rum efter Ang II stimulering. Subcellulære afsnit er mærket med fluorescerende proteinkimærer eller andre fluorescerende markører. Denne protokol kan også anvendes som en første tilnærmelse til lokalisering receptorer i subcellulære organeller med en minimum opløsning på 200 nm for at sammenligne muteret versus vildtype-receptorer eller til at detektere ændringer efter farmakologiske behandlinger. Teknikken er tilgængelig, da den kan udføres på en hvilken som helst konfokalt mikroskop udstyret til live-cell imaging. Den relative lethed af denne tilgang i kontrast med øget ekspertise og nødvendige udstyr til at udføre FRET / FLIM / Bret teknikker, som detekterer molekylære interaktioner 6,"xref"> 11. Disse målinger definerer protein-protein-interaktioner med høj opløsning (~ 10 nm) og lokalisering inden subcellulære organeller er udledt. Disse mere avancerede teknikker bruges til at følge op og yderligere at definere molekylære interaktioner af interesse, snarere end passagen af receptorer gennem subcellulære rum, og de direkte demonstrere protein-protein interaktioner på bestemte tidspunkter og steder i cellen 11. FLIM, en FRET teknik uafhængig af acceptor koncentration, er oftest udført på faste prøver, da billedet erhvervelse er langsommere. I modsætning hertil forholdet FRET tilvejebringer hurtig billeddannelse og høj opløsning colokalisering af interagerende proteiner. Ulempen ved forholdet FRET er, at billedbehandling udnytter Vidvinklet epi-fluorescens at få billedbehandling hastighed og til at omfatte hele cellen, hvilket resulterer i reduceret opløsning og kontrast af organeller 12. Bioluminescens resonans energioverførsel (BRET) er en andenavanceret teknik, som har været anvendt på GPCR'er at måle erhvervelse af molekylære lighed over tid 11. I denne teknik et protein fluorofor er molekylært delt og hver halvdel knyttet til en af to proteiner pågældende. Når de to proteiner af interesse binder hinanden, de dele af det kimære tag saml at erhverve fluorescens og den øgede fluorescens kvantificeret over tid.
Her præsenterer vi en enkel teknik til live-cell imaging kombineret med billedet kvantificering at studere handel med AT 1a R i cellen på Ang II stimulering og den potentielle ændring af levering af internaliseret AT 1a R til lysosomer efter Ang II stimulation. Den endelige anvendelse for denne teknik er at karakterisere forskelle i membranen trafficking sammenligner vildtype og muterede receptorer. Disse forskelle vil bidrage til at identificere den mekanisme (r), som påvirker fysiologiske aktiviteter i AT 1a R leading til regulering af blodtrykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dag et
1. Cell Seedning
- Forbered komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM). Tilsæt 50 ml føtalt bovint serum, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml L-glutamin til 450 ml DMEM til at gøre 500 ml komplet DMEM suppleret med føtalt bovint serum (10%), penicillin / streptomycin (1%) og L-glutamin (1%).
- Seed humane embryoniske nyre (HEK) celler, passage nummer 6-11 ved 50.000 / brønd i en 8 brønd kamre dækglas systemet i komplet DMEM.
- Opretholde den kamre objektglas ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 i 24 timer.
dag to
2. liposomtransfektion
- Frisk gøre AT 1a R-GFP plasmid og liposomopløsninger hjælp sterile forhold med en biosikkerhed niveau 2 kabinet.
- Fortynd 2 pi plasmid-DNA til 900 ng / pl stamopløsning i 178 pi af nedsatte serum medier for at opnå en koncentration af plasmid-DNA på ca. 10 ng / pl.
- Fortynd 4,5 pi af liposom stamopløsning i 175,5 pi af nedsatte serum medier til at skabe en 1:40 fortynding af bestanden.
- Tilføj liposomopløsningen til plasmidet opløsningen og bland ved anvendelse af en 1 ml pipette at pipettere op og ned 20 gange for at blande transfektion opløsning.
- Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur (25-27 ° C).
- Mens denne blanding inkubering fjernes medierne langsomt med en 1 ml pipette og tilsæt langsomt 400 pi 1x phosphatpufret saltvand (PBS), der er forvarmet til 37 ° C.
- Fjern forsigtigt PBS og erstat med 200 uL / brønd af reduceret serum medier forvarmet til 37 ° C.
BEMÆRK: Vær forsigtig på alle trin, når vask af cellerne for at undgå frigørelse af celler fra dækglasset grundet sheer stress fremkaldt af pipettering. - Opretholde cellerne ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 i 30 min.
- NårInkubationstiden er overstået, tilsættes 80 pi transfektion mix til hver brønd og inkuber cellerne i 4,0-4,5 time, men ikke mere end 5 timer ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2.
- Efter transfektion inkubationsperiode er fuldstændig, langsomt fjerne mediet fra kamrene under anvendelse af en 1 ml pipette og forsigtigt erstatte med 300 uL / brønd af komplet DMEM og inkuberes celler i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 .
dag tre
3. Serum Sult
- Fjern mediet forsigtigt med en 1 ml pipette og langsomt erstatte med 300 pi serumfrit DMEM uden phenolrødt.
- Oprethold kammeret ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 i 10-12 timer.
Dag Fire
4. Levende Cell Imaging
- Stain intracellulære rum (lysosomer i dette tilfælde).
- About 30 minutter før billeddannelse lysosomer i celler, tilsættes 22,5 pi fra en 1 pM fluorescerende farvestof stamopløsning (0,5 pi af 1 mM fluorescerende farvestof fortyndet i 499,5 pi serumfrit DMEM uden phenolrødt) til hver brønd i en endelig farvestofkoncentration af 75 nM.
- Inkuber i 25-30 min ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO2 og derefter forsigtigt fjerne farvestoffet og tilsæt langsomt 300 pi frisk serumfrit DMEM uden phenolrødt.
- Forbered mikroskop for billeddannelse.
- Juster scenen ned for at undgå beskadigelse af linsen under opstart af et automatiseret mikroskop.
- Tænd mikroskopet magt, scanner magt, lasereffekten og derefter laser emission, og endelig metalhalogenlampe til visuel observation (se konfokale mikroskop producentens instruktioner).
- Åbn program til billedbehandling og i softwaren igen på argon (488 nm) laser og magt op til 30-50%. Bemærk strømmen afhænger afalder af laser. Inden for eksperimenter er det afgørende at fastholde konstante indstillinger.
- Tænd rød udsender laser (f.eks 568 nm eller 594 nm).
- Indstil imaging format til 12-bit dybde.
- Indstil pinhole for argon laser linie 488 nm og for 568 nm eller 594 nm laser til en Airy disk enhed. Hvis GFP er meget dim, bruge en indstilling af 2 Luftige disk enheder, men matche kanalerne korrekt.
- Ved anvendelse af dikroiske filtersæt, vælge de relevante emissionsbølgelængder for GFP og det fluorescerende farvestof. Eller sæt emission bølgelængde (Em) ved 499-580 nm for GFP og Em 599-680 nm for den rød-udsender fluorescerende farvestof.
- Kontroller at bløder igennem og crossover ikke forekommer. Sluk hver laser efter tur og tjek begge emissioner kanaler for hver. Når Argon laser er slukket, skal den grønne emission til nul. Når den grønne emitterende laser er slukket, skal den røde emission kanal til nul.
BEMÆRK: Den sikreste metode er at billedet hver i separate spor (sequirentielle). - Medtag en brightfield kanal, hvis det ønskes. Undgå differential kontrastbilledteknik (DIC), fordi det kan skew co-lokaliseringstoppe målinger.
- For levende billeddannelse, vælg linje sekventiel snarere end rammen sekventielle.
- Vælg celler til billeddannelse.
- Anvende en 1,4 numerisk åbning (NA) mål, såsom en 63X / 1.4 NA olie formål at afbilde celler (eller 40X / 1.4 NA). Centrer objektiv og tilføje en dråbe høj viskositet, lav autofluorescens fordybelse olie på målet.
- Overfør kammeret med de transficerede celler fra inkubatoren til den fase af mikroskopet. Vær omhyggelig med at holde dias flad og sikre, at kammeret er godt siddende og forhindret i bevægelse.
- Flyt målet indtil dråbe olie netop rører bunden af slæden; højre brændplanet er nær til denne position. I automatiske mikroskoper, gemme denne position samt den sænkede stilling skal bruges til remainder af afbildningseksperiment at lette skiftende prøver.
- Vælg dim celler. Celler, der overudtrykker AT 1a R-GFP vil bortlede receptoren i cellen og forstyrre normal funktion.
- Bekræfter, at omridset af cellen, defineret af plasmamembranen, er synlig og fortrinsvis ikke overlapper med andre celler.
- Fokus og centrere celle i synsfeltet.
- Skift til konfokal tilstand.
- Vælg en hurtig billedbehandlingstype. Med den ene hånd om kontrol fokus og den anden på scenen XY kontrol, fokus og centrere cellen af interesse visualiseret på skærmen.
- Bekræft, at cellen af interesse er godt spredt, og dens bund eller ventrale side sammenstillet tæt sammen med dækglasset ved at fokusere op og ned gennem cellen.
- Indstil parametre z-etape til billedet en celle i 3D.
- Vælg knappen On for Z-stack top og bund dialog (eller tilsvarende) og fokusere på bunden af cell tryk derefter på "begynder". Derefter fokus til toppen af cellen og tryk på "ende". Kontrollér at hele cellen er inkluderet i z-stakken.
- Indstil Z-trinstørrelse til 1,0 um.
- Angiv indstillinger billeddannelse.
- Vælg Zoom 2, afhængigt af linsen, så den endelige pixelstørrelse er omkring 0,279 um x 0,279 um til 0,14 um x 0,14 um i XY dimension.
- For HEK-celler i dette eksperiment, indstille scanningshastighed på ca. 1 mikrosekund pr voxel og vælg 2 midling eller 2 akkumulationer efter linje, afhængigt af lysstyrken af celler.
- Juster laser intensitet og få til afbildning GFP og det fluorescerende farvestof. Generelt vil counterstains være meget lysere, og derfor Photomultiplier detektor (PMT) og ikke galliumarsenidphosphid (Gaasp) eller Hybrid detektorer (HYD) bør udnyttes til denne anden farvekanal det er noedvendigt gisp og Hyd detektorer for GFP kanal. Hvis Hyd eller Gaasp registrererors anvendes til fluorescerende farvestof, udøve forsigtighed og starte med laseren på et ekstremt lavt strømforbrug.
- Indstil varighed af scanning og hyppigheden af scanning, for eksempel til hver 30-60 s over 25 min eller længere se målretning af AT 1a R-GFP til lysosomer.
- Indstil autofokus at opretholde fokusplanet stabilitet over tid.
- Begynd afbildningseksperiment.
- Forberede sig på forhånd 100x Ang II lager ved 5 ug / pi (4,7793 mM) og tilsæt 2,1 pi dette til 998 pi medium (10 uM).
- Begynd ligand stimulation ved tilsætning af 3 pi af en 100 x stamopløsning af ligand (Ang II) til brønden indeholdende 300 uL umiddelbart før billeddannelse (slutkoncentration 100 nM).
- Klik på start og billede i 3D til den ønskede tid og frekvens.
- Før du afslutter arbejde i mikroskop, indsamle en z-stak til senere brug i baggrunden subtraktion under analysen. I foton optælling tilstand, er dette ikkenødvendig, da baggrunden i det væsentlige 0. Med belysning tændt og alle andre billeddannende betingelser den samme, men med ingen prøve tage et prøvebillede. Se Baggrund Subtraktion (nedenfor) under analyse.
Dag Fem
5. Image Analysis
- Eksport af billeder til TIFF-format.
- Højreklik på navnet på billedfilen for at se menuer og vælg Export eller klikke på Filer | Eksport | importere.
- Eksporter til tiff for efterfølgende analyser og sørg for at eksportere RAW, 12-bit data [ikke den "Rød Blå Grøn« (RGB) omregnet til offentliggørelse kvalitet billeder]. Må ikke eksportere til jpeg-format.
- Bemærk X, Y, Z voxel dimensioner og z-trinstørrelsen til senere brug under billedanalyse. For eksempel ved anvendelse af en 40X / 1.4. NA objektiv disse værdier kan være 0,138 um x 0,138 um med 1 um z-trins størrelse (se data i afsnittet repræsentative resultater).
- <strong> Opret billedstak til analyse.
- Åbn billede Kvantificering software (figur 2)
- Brug "Action | Opret ny | Billeder fra Selected Sequence" for at generere en enkelt fil billede fra importerede enkelte sekvenser (figur 2, pil 1 #).
- Indtast antallet af kanaler, antallet af z-sektioner, og antallet af tidspunkter.
- Afhængig af strukturen af de * .tiff filer ved at vælge, for eksempel, kanaler, z-planet, og tidspunkter som rækkefølgen af billedet fly. Kontroller, at det endelige billede stakken korrekt repræsenterer farvekanalerne, z-stack, og tidspunkter af originalbilledet.
- Vælg navnet billedet (Figur 2, fremhævede fil navn til venstre, pil # 2). Højreklik på billedet og / eller billedfeltet, og fra valgmulighederne nederst på listen vælg "Egenskaber". I um pixel for (X) (Y) og (Z) størrelse, indtaste de korrekte billedegenskaber nævnt ovenfor.
- Træk baggrund før billedanalyse. Baggrund korrektion kan udføres i enhver billedanalysesoftware. Træk baggrund ved hjælp af en af to muligheder.
- Mulighed 1: Vælg "Action | Opret ny | Baggrund Subtraktion" (Figur 2, pil # 1). Brug den erhvervede baggrundsbillede opnået ved slutningen af det billeddannende session er beskrevet ovenfor som "Mørk reference" Image under "Tools | Træk baggrund".
- Mulighed 2: Undersøg de mørkeste områder i billederne, hvor der ikke prøve, find middelværdien eller maksimal lysstyrke på pixels i denne region, ignorerer eventuelle usædvanligt lyse pixel, der kunne være falsk fluorophor, en tilfældigt lys pixel, eller en anden fænomen. Vælg "Handlinger | Opret ny | Baggrund subtraktion". Brug denne pixel lysstyrke (lavet negativ) som offset.
- Check for farveregistrering og korrekt om nødvendigt.
- Generer en registrering korrektion ved at vælge "Handlinger | Opret ny | korrigeringsoversigt" (Figur 2, pil # 1) og bruge dialogboksen til at foretage justeringer. Ved afslutningen af en ny mappe punkt vil vises titlen "korrigeringsoversigt".
- Påfør registrering til et eller flere af de billeder af, ved at klikke navn billedet (Figur 2, fremhævede fil navn til venstre, pil # 2) og derefter vælge "Funktioner | Korrekt Registration" (Tool knappen ved siden af aktioner).
- Vælg et billede (figur 2, fremhævede filnavn til venstre, pil # 2) og tegne et område af interesse (ROI) omkring en enkelt celle ved hjælp af freestyle region værktøj (figur 2, pil 3 #). Brug Udvidet Focus mode (2D, drop down menu på øverst til venstre) til at observere cellen som beskæringsværktøjet fungerer kun i 2D visualisering.
- Højreklik på billedet og vælg "Crop til Selection" og et nyt billede element er genereret.
- Vælg den beskårne celle ved at klikke på dens navn og derefter vælge "Måling" fanen ovenfor (Figur 2, pil # 4).
- At definere og måle internaliserede vesikler for GFP, træk "Find objekter" under "Finding" (Figur 2, pil 5 #) i sekvens boks (Figur 2, pil 6 #).
- Indstil "Find objekter" Channel til GFP-kanalen.
- Åbne indstillinger (hjul ikon i dialogboksen, pil # 6) og sæt4; Threshold hjælp: "til SD og" nedre grænse "til 6. Indstil" Minimum objekt størrelse "til 0 um 3.
BEMÆRK: SD nedre grænse vil afhænge af de enkelte forsøg. Visuel bekræftelse, at de korrekte objekter er tærsklingsbehandlet foretages ved at undersøge forskellige tidspunkter (figur 2, pil # 7). Den "Måling | Feedback Indstillinger" dialogboksen bruges til at vælge den måde, at udvalgte tærsklingsbehandlede objekter visualiseres (figur 2, pil # 8). - Klik på "Mål" i "Find objekter" dialogboksen (Figur 2 arrow # 6) og vælge de kanaler og typen af målinger. Typisk skal du vælge "Alle kanaler" og "intensitet og volumen målinger".
- At definere tærskelværdier og filtre til identifikation af hele cellen og måle total GFP intensitet, gentag ovenstående trin (5.5.4 - 5.5.8) ved hjælp af følgende parametre: SD 0 og "Minimum Object size" til 2 μm 3 i den anden "Find objekter" dialogboksen til at identificere celler ved hjælp GFP (figur 2, pil # 9)
- Træk "Filter Befolkning" under "Filtrering" til sekvensen feltet under befolkning 2 (den anden "Find objekter" kasse, figur 2, pil # 9). Vælg "Volume (um 3> 100).
- Visuelt sikre, at kun ét objekt er identificeret. Hele cellen bør tærsklingsbehandles og alle andre objekter filtreret væk. "Filter" parameter (r) skal måske justeres hvis cellen er lille, f.eks.
- Når målingen er blevet standardiseret, gemme protokollen ved at højreklikke på billedet og vælg "Save Protocol" for at genbruge ( "Gendan protokollen"). Protokollen kan også eksporteres til at give en post i samme undermappe som billedet.
- Fortsæt til "Gør måling" ved at vælge "Målinger | Make Måling Item" (figur 2
- Indtast den korrekte måling navn (kopierer indsætte fra billedet er praktisk) og analyse kode eller dato (en hjælpsom tilføjelse til registrering), og vælg "Alle tidspunkter". Et nyt regneark element vil blive oprettet under billedet. Hold filnavne kortfattet.
- Klik på filnavnet regnearket og vælge fanen "Analyser". Undersøg, om mættede voxels er til stede ved først at vælge "Begræns Analyse til:" Vælg Befolkning 2 (cellen).
- Højreklik på feltet under "fanen Analyser", og i dialogboksen under "Analyser af disse data:" Vælg "Max ([GFP farvekanal])"; under "sammenfattes:" vælg "Mean ([GFP farvekanal]" og under "Organiser dataene ved:" og "Row" vælg "tidspunkterne" og klick "OK".
BEMÆRK: Hvis data indeholder mættede pixels (f.eks 65.536 for 16-bit eller 4096 for 12-bit), vil analysen ikke være korrekte (det vil undervurdere vesikel indhold). Se bort fra denne celle til analyse. Hvis ikke mættet, gå videre til næste trin. - Dernæst under "Rå" fanen og derefter under "Analyse" fanen og højreklikke dataene find "Begræns Analyse til:" og derefter vælge Befolkning 1 for vesikler eller Befolkning 2 for hele cellen.
- Under "Analyser disse data:" vælg "Sum" (GFP farvekanal); under "sammenfattes:" vælg "Sum"; og, under "Organiser dataene ved:" og "Row" vælge "tidspunkterne" eller "Relativ Time" og derefter klikke på "OK". Analyse valg kan gemmes og genbruges.
- Vælg og copy / paste direkte fra billede kvantificering software til en tom regneark eller eksportere regnearksdata ved at højreklikke på daten og vælge Gem som .csv-fil. Hele celle intensitet måling vil blive inkluderet med målinger af hver vesikel i befolkningen, så sørg for at identificere og adskille den fra de blærer.
BEMÆRK: Efter plotte data, stigningen i den samlede GFP-fluorescens indeholdt i vesikler hurtigt stiger. Fotoblegning, hvis det sker, registreres som tab af total celle GFP intensitet over tid.
- I Find Objekter (Population 1), der er "Find objekter" Channel til den røde kanal og hjul ikon inden for denne dialogboks angivet med pilen # 6 (figur 2) sæt "Threshold hjælp:" til SD og "nedre grænse" til 6. Indstil "Mindste objekt størrelse" til 0,017 um 3.
BEMÆRK: SD nedre grænse vil afhænge af de enkelte forsøg. Visuel bekræftelse af, at de korrekte objekter bliver tærskelværdi bør foretages af eksamenlingen forskellige tidspunkter. Den "Måling | Feedback Indstillinger" dialogboksen bruges til at vælge den måde, at udvalgte tærsklingsbehandlede objekter visualiseres (figur 2, pil # 8). - Klik på "Mål" i "Find" objekter "(Figur 2 arrow # 6) og vælge de kanaler og typer af målinger. Typisk" Alle kanaler "og" intensitet og volumen målinger "er valgt.
- For Population 2, use indstillinger er identiske med den, der anvendes til at identificere hele transficerede celle udtrykker AT 1a R-GFP (5.5.9).
- Hvis flere celler (herunder utransficerede celler med fluorescerende farvestof-positive vesikler) er til stede, beskæring cellen på den første fase af analysen er kritisk. Alternativt bør anvendes brugen af "inddeler" for at begrænse identifikation af lysosomer inden den transficerede celle udtrykker AT 1a R-GFP. Lysosomer må kun identificeret inden GFP celle ogikke fra nærliggende, utransficerede celler.
- Analyser og eksportere data som ovenfor.
BEMÆRK: Et eksempel på tærskel-celler og vesikler er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne repræsentativt sæt eksperimenter blev HEK-celler transficeret med angiotensin typen 1a receptor (AT 1a R-GFP) konstruktion (E1,2,3-AT 1a R) klonet i pEGFP-N2 plasmid 13. Time-lapse billeder af HEK blev erhvervet og spillede som en film (Se levende celler 1 og live Cell Imaging 2 film). De film og stillbilleder viser, at efter ligand stimulation, AT 1a R-EGFPs er lokaliseret overvejende i plasmamembranen, men med tilføjelsen af Ang II disse receptorer bliver internaliseret i 2,5 min til dannelse lyse vesikler og på senere tidspunkter klynge i større vesikler i en perinukleær zone (figur 4B, 5 og 6A, levende celler 2).
Kvantificering af total celle GFP intensitet og total vesikel GFP intensitet for cellen i figur 5 provide en illustration af de komplikationer iboende når Ang II inducerer ruffling og celle formændringer umiddelbart efter stimulering (figur 5A, pil ved 0 minutter efter Ang II, øverste række, orange indikerer tærsklingsbehandlede objekter). På senere tidspunkter, lokaliseringen af GFP-holdige vesikler i en perinukleær klynge også griber (figur 5A, rød pil på 29,5 min). Selvom alle objekter bør indgå i den samlede celle GFP intensitet måling, bør flæser udelukkes fra vesikel målinger som de repræsenterer plasmamembranen AT 1a R-GFP. Derimod bør de grupperede perinukleære vesikler ikke udelukkes fra vesiklen målingen (sidstnævnte ses i et område af cellen indesluttet i røde cirkler i figur 5A, pil på 29,5 minutter efter Ang II, nederste række). Forsøg på at opnå dette ved størrelse filtrering (mere eller mindre end 7 um 3) ikke var nyttigt, da det ikke kunne diskriminere flæser og grupperet vesicles (figur 5A og 5B, sammenligne Filter> 7, Filter <7, og ingen filter). Et muligt alternativ ville være at tegne et Regioner Interessante (ROI) omfatter den cytoplasmatiske del af cellen, men eksklusive ruffling kant og omkreds af cellen. I sidste ende ville denne celle ikke blive inkluderet i kvantitative resultater, fordi der var mættede pixels af GFP stede.
Et andet repræsentativt eksempel er vist i figur 6A illustrerer et tidsforløb, hvor autofokus ikke blev anvendt. Den internaliseret GFP er vist som procent totalt cellulært GFP (figur 6B). De tidspunkter forud for den røde pil på 3 min vildledende, kun en del af cellen var i imaging volumen, men tre minutter efter Ang II kommer, fokusplanet stabiliseres igen. Det samlede GFP i cellen viser, at denne celle ikke photobleach mærkbart over tid (figur 6C ). Mellem 3 og ca. 12 min, procent GFP intensitet i vesikler stiger derefter flader ud (figur 6B). Derefter blev lysosomer identificeret ved fluorescerende farvestof anvendes til at identificere ROI'er inden for en transficeret celle, som derefter blev kvantificeret for summen af GFP intensitet (figur 6D). Efter tre minutter, går intensiteten af AT 1a R-GFP i røde identificerede lysosomer ikke variere over tid (figur 3D, n = 5, middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien). Der er således ingen påviselig forøgelse i levering af AT 1a R-GFP'er til lysosomerne i op til 24 minutter efter Ang II administration.
Figur 1: Mættet Pixels Identificerede i en Opslagstabel (LUT). Den røde pil viser mættede pixels vist i blåt.t = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Oversigt over Billede Kvantificering Software. Vigtige elementer er angivet med tal, og drøftet i metoder tekst. 1) Handling emne, 2) Udvalgt billede, 3) fri hånd ROI værktøj, 4) fanen Målinger, 5) Find Objects, 6) Befolkning 1 Find Objects dialogboksen 7) Arrow aktivering tid bortfalder film, 8) Målinger element, 9) en anden Find Objects dialogboks, der indeholder en Filter Befolkning kommando. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Farve korrigeringsoversigt. Billeder med ukorrigerede ogkorrigeret pixel registrering vises sammen med mellemværker af flere colocalizing vesikler indeholdende 1a R-GFP. De røde pixels forskydes 1 pixel til venstre i XY-planet af ukorrigerede billede. Mellemværker viser boxed områder på højere forstørrelse. Scale bar = 3,3 um, voxel dimensioner = 0,138 x 0,138 x 1 um 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Illustration af Thresholding at identificere GFP- og fluorescerende farve-holdige vesikler og GFP-hele celler. (A) Identifikation af hele celler ved hjælp af AT 1a R-GFP (GFP, øverste række) og tærsklingsbehandlet GFP for hele cellen (ID Cell, nederste række) er vist ved 0 og 2,5 min efter Ang II tilsætning. Hvide felter angiver insET områderne vist i (B) og (C). (B) AT 1a R-GFP'er sammenlignes ved 0 og 2. 5 minutter efter angiotensin II tilsætning i enkelte farvebilleder (øverste række). Vesikler identificeret ved tærskling er vist i den nederste række (ID Ves, lilla). (C) To farvebilleder (AT 1a R-GFP / fluorescerende farvestof) er vist ved 0 og 2,5 minutter efter Ang II tilsætning. Lysosomer identificeret ved tærskling er vist med røde konturer. Scale bar = 7,0 um, voxel dimensioner = 0,114 x 0,114 x 1,4 um 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Illustration af virkningerne af Flæser og Clustered Blærer på måling af internaliseret GFP receptorer. (A) A T 1a R-GFP i Ang II-behandlede celler ved 0 (øverste række) og 2,5 minutter (nederste række) er vist i tre filtrering forsøg, hvor i den første kolonne et filter blev anvendt til at vælge kun objekter større end 7 um 3, i anden kolonne til at vælge objekter mindre 7 um 3, og i tredje kolonne blev brugt noget filter. Thresholding niveau var konstant i alle tre. Pile viser store tærsklingsbehandlede objekter, cirkler angiver et område med cytoplasmaet indeholdende perinukleære vesikler på senere tidspunkter. Tærsklingsbehandlet områder er orange. (B) Kvantificering af GFP totale intensitet i vesikler er vist for tærsklingsbehandlede områder med eller uden størrelse filtrering (ved søjle i A) ved to tidspunkter (for række i A). Voxel-dimensioner var 0,138 x 0,138 x 1 um 3. Scale bar = 5,6 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Sporing AT1 en R- GFP Internalisering og Potentiel Lokalisering i lysosomer. (A) Fem udvalgte tidspunkter i AT 1a R-GFP med LYSOTRACKER Red er vist fra den ledsagende film (Live cell imaging 1 film) ved 0, 3, 6, 9, og 12 minutter efter Ang II. Gitteret repræsenterer en enhed skala fra 6,56 um 3, voxel dimensioner var 0,297 x 0,297 x 1,2 um 3, og z-trins = 1,2 um. (B) Et plot af procent total GFP i vesikler med tiden illustrerer den hurtige internalisering af AT 1a R-GFP. (C) Et plot af det samlede GFP i cellen over tid viser, at relativt lidt fotoblegning opstod under 24 min for billeddannelse. (D) Lysosomer blev identificeret ved at identificere LYSOTRACKER Rød-positive vesikler. Den samlede GFP intensitet inden fluorescent dye-positive vesikel ROI'er blev målt ved hvert tidspunkt (normaliseret til det første tidspunkt med ingen kompensation for fotoblegning som ikke var uafhængigt målt). (C - D) Før pilen, målingerne er ikke gyldig, da fokus flyttet. N = 5, gennemsnit ± standardfejl på middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Levende Cell Imaging 1: (Højreklik for at downloade) HEK-celle transficeret med AT 1a R-GFP blev afbildet hver 1 min for 24 min (25 billeder) efter tilsætning af 100 nM Ang II. Film blev erhvervet ved hjælp af en laser konfokalt med en Plan-Apochromved 63X / 1.4 NA olie formål, voxel dimensioner 0,279 x 0,279 x 1,2 um 3; og 5 skiver for i alt 4,794 um tykkelse afbildet på 3,20 mikrosekunder / pixel. Filmen sats er 2 billeder / s. Enhed = 6,56 um.
Film 2: levende celler 2: (Højreklik for at downloade) HEK-celle transficeret med AT 1a R-GFP blev afbildet hver 30 s i 25 min (51 rammer) efter tilsætning af 100 nM Ang II. Film blev erhvervet ved hjælp af en laser konfokalt med en Plan-Apochromat 40X / 1.4 NA olie mål. Voxel-dimensioner var 0,11 x 0,11 x 1,4 um 3. 7 udsnit til i alt 8,4 um tykkelse blev afbildet på 3,72 s / ramme. Filmen sats er 3 billeder / s. Scale bar = 7 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Indledende forsøg præsenteret her viser, at over en temmelig kort tidsforløb for 24 min, ingen mærkbar ændring i leveringen af AT 1a R-GFP til lysosomerne indtraf. Generelt kunne levering af internaliserede receptorer til lysosomer forekomme så tidligt som 15-20 min. Dette eksperiment er i overensstemmelse med den hypotese, at hovedparten af den internaliserede AT 1a R er målrettet til store, perinukleære endosomer. Dokumentation for, at i det mindste nogle AT 1a R ankommer i lysosomer blev demonstreret af Li et al. , Der sammenlignet celler ved 5 min og 30 min efter Ang II behandling og fundet signifikant colokalisering af LAMP1 med AT 1a R ved 30, men ikke 5 min 6.
Dette dokument indeholder en detaljeret beskrivelse af celle forberedelse, billedbehandling og trin analyse og diskuterer de mange iboende faldgruber i denne avancerede imaging teknik. Denne metode afhænger kritiske trin beskrevet nedenfor.
Da godt helbred af celler er kritisk for enhver levende celler eksperiment, er det vigtigt at undgå at bruge celler ud over passage 11 på grund af ændringer i vækstrater og transfektionseffektivitet ved højere passager. For at opretholde sunde celler i hele eksperimentet, bør inkubationstiden for transfektion blandes med celler ikke overstige 5 timer siden liposomopløsningen er toksiske for celler, der repræsenteres ved øget membranblæredannelse. Temperatur, fugtighed og CO 2 kontrol er væsentlig såvel før som under billedbehandling. Driver i temperatur under billedbehandling kan forårsage relativt store z-sektion driver og tab af fokusplanet stabilitet. Derfor anbefales ekstra forsigtighed ved tilsætning af Ang II til cellerne under billedbehandling at sikre, at brændplanet nøjagtigt opretholdes.
Imaging
En fordel ved live-cell imaging løbet immunfarvning under anvendelse fikserede celler erat de in vivo betingelser kan styres nøje, og kan undgås artefakter forbundet med fikserede celler. Dog kan live-cell imaging være en udfordring at optimere til cellulære processer, der er ekstremt hurtige, ligesom receptor internalisering. Instrument hastighed og behovet for at undgå fotoblegning grænse valg af begivenheder, der kan studeres. Hver imaging eksperiment kan kræve visse valg, der skal foretages i nogle parametre og kompromiser i andre; eksempler er valg i pixelstørrelse, line ophobning, zoomfaktor, og scanning hastighed for at få data af god kvalitet til analyse og undgå oversampling på samme tid. Kritiske beslutninger i disse faktorer afhænger afvejning af behovet for at opnå tilstrækkelig pixelstørrelse at skelne de enkelte blærer og behovet for at opnå tilstrækkelig tidsmæssig opløsning af de begivenheder, der opstår. nogle kompromiser skal således ske med henblik på at erhverve oplysninger hurtigt nok som cellen begynder at internalisere GFP-mærkede receptor. I vorestilfælde, selv om moderne konfokal software kan foreslå den optimale pixelstørrelse, vore eksperimenter anvendte en værdi mindre end den optimale pixelstørrelse efter Nyquist ligning 14. Optimale valg af indstillinger for andre eksperimenter vil også afhænge af, hvor lyst cellerne da større pixelstørrelse vil give hurtigere ophobning af fotoner tillader en afvejning med længere voxel opholdstid til at indsamle flere fotoner.
Til analysen skal lykkes, live-cell imaging også kritisk kræver nøjagtig omdrejningspunkt stabilisering under tidsforskudt billeddannelse. Focal forskydninger samt manglende billedet hele cellen kan have dybtgående indvirkning på kvantificering af receptor internalisering samt total cellulære GFP intensitet. Løsningen på dette problem med fokale skift under tidligste tidspunkter af imaging efter tilsætning af Ang II er leveret af konfokale producenter i form af autofokus løsninger, hvor dækglas interferomEtry med en IR-laser kombineret med feedback til automatiseret fokus kontrol anvendes til at opretholde relative afstand fra målet til dækglasset overflade identificeret ved IR reflektion (f.eks Definite Focus eller Adaptive Focus Control). Den resterende problem af microscopist derefter at identificere den korrekte z-range så trods formændringer, hele cellen forbliver i den billeddannende volumen. Temperatur er en anden kritisk faktor til at fastholde fokus / Z position under indledende tidspunkter efter tilsætning af Ang II. Temperaturen af målet samt levende celler kammer bør opretholdes ved 37 ° C under hele forsøget.
En anden afgørende element i billedbehandling, erhverver billeder kvantitativt. Hvis der anvendes en Hyd detektor i Photon Counting tilstand, skal de billeddannende parametre indstilles således, at foton pileup ikke forekommer. For PMT'er og andre detektorer, skal billederne ikke indeholde mættede pixels (voxels). I begge tilfælde er en specialized look-up tabel (LUT) kan bruges til at visualisere tilstedeværelsen af mættede pixels og selvfølgelig, hvis de er til stede, bør microscopist reducere laser intensitet og / eller gevinst.
Analyse
Selv om det synspunkt her påføres AT 1a R-receptor og dens co-lokalisering med lysosomer, er den anvendelig til forsøg, hvor den relative mængde af receptoren i subcellulære afsnit mærket med forskellige fluorescerende mærker er på forespørgsel. Hvis målet er at måle, om de receptor flytter til organel, derefter bruge en Pearsons colokalisering koefficient med en markør for organel er problematisk. Hver pixel hvor organel er identificeret, vil have en høj mængde af markøren, således at en af koefficienterne vil altid være nær 100%. Således kunne co-lokaliseringstoppe målinger være vildledende. På den anden side, måle procent af receptoren på organel versus samlede receptor er meget mere informativt og tydeligere at fortolke. En sag, hvor protein colokalisering bedst kan beskrives ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient ville være på 1a R receptor og LAMP1 hvis samspil er blevet dokumenteret, om end med en mere sofistikeret colokalisering tilgang, nemlig FLIM / FRET 6.
Brugen af 3D imaging er mere præcis end at bruge repræsentative udsnit af celler med analyse i 2D på grund af cellulære bevægelser, der er uundgåelige i tidsforløbet (Live Imaging 2 film). Det fremgår klart af de levende celle illustrationerne i figur 3, 4B og 5A, at receptoren primært er lokaliseret på plasmamembranen, men inden for et par minutter af udsættelse for Ang II det lokaliserer til lyse pletter på membranen og små vesikler støder op til membranen, sandsynligvis overtrukne gruber og tidlige endosomer (figurerne 4B 4C). Under fortsat progression af tid, vesiklerne bevæger sig gennem cellen akkumulere i større vesikler støder op til kernen, som er blevet beskrevet som multivesikulære endosomer (MVEs figur 1, 5A) 3, 15. En enkelt skive gennem cellen over tid ville forvride internalisering proces og misvisende billede de sande begivenheder især hvis skive ikke omfattede celleoverfladen på tidlige tidspunkter, og MVEs på senere tidspunkter.
I denne undersøgelse kan to tilgange til billedanalyse minimere virkninger af fotoblegning af GFP samt fluorescerende farvestof på det kvantitative resultat. Som celler photobleach (omend i begrænset omfang), er den relative lysstyrke internaliserede vesikler i forhold til hele cellen intensitet opretholdt under antagelse fotoblegning forekommer ensartet. Fluorescerende farvestof-positive vesikler er også let identificeres ved at vælge standard deviation af den gennemsnitlige fluorescensintensitet mulighed for tærsklingsrutine lyse internaliserede vesikler. Dette adskiller dem fra baggrunden ligesom hele niveauet af fluorescens falder. Således er vores målinger var ikke følsomme over for virkningerne af beskeden fotoblegning. stærk fotoblegning såsom 50% tab af celle intensitet over tid, kan dog have en større indflydelse på kvantitative resultater. Alternativt kan virkningen af fotoblegning måles uafhængigt i kontrolforsøg fraværende Ang II i tilfælde af AT 1a R-GFP eller på tilstødende utransficerede celler i tilfælde af fluorescerende farvestoffer. Virkningerne af fotoblegning kunne så være indregnet i under analysen.
Yderligere Bekymringer
For nylig har cellebiologer udført kritisk vurdering og modifikation af fluorescerende proteiner til overvågning membran handel med celler for at undgå artefakter genereret af selve det fluorescerende protein, uafhængigt af proteinet being tagget. Forskellige fluorescerende proteiner er sårbare over for interaktioner med det lokale mikromiljø fører til protein udfældning eller tværbinding baseret på deres pKa-og nærvær af aminosyren cystein, henholdsvis 16. Et andet resultat af disse interaktioner kan omfatte tab af fluorescens 16. Alle disse artefakter påvirker kvantitative målinger for menneskehandel. Constantini et al. har genereret monomere fluorescerende proteiner til billeddannelse, som mangler cystein for at eliminere potentielle artefakter 16. Således, afhængig af målet med de billeddannende forsøg skifte fra EGFP (ikke-monomer) til en monomer, ville cystein-fri form være fordelagtig for studier af sure og / eller reducerende vesikulære mikromiljøer. Et andet eksempel kunne være deres forbedret anvendelighed til FRAP eller FRET eksperimenter, hvor multimerisering og krydsbinding ville påvirke protein diffusion og protein-protein interaktioner.
En anden potentiel artefakt at overveje, når billeddannelse lysosomer hjælp LYSOTRACKER Red sammen med GFP fusionsproteiner er, at LYSOTRACKER Red har vist sig at være i stand til fotoomdannelse til grøn 17. Forfatterne anbefaler, at minimeres anvendelse af epifluorescensbelysning, diskutere forekomster af denne artefakt, og henviser til vellykkede eksempler på co-lokalisering ved hjælp af denne reagens. Derudover kan andre markører for lysosomerne også anvendes til at verificere co-lokaliseringstoppe resultater, for eksempel mærkede LAMP1 6.
I fremtiden kan følsomheden og specificiteten af dette assay undersøges for receptor målretning til lysosomer samt andre subcellulære afsnit ved hjælp inhibitorer af vesikel transport og / eller fusion, ved at inhibere lysosom forsuring ved anvendelse bafilomycin at blokere nedbrydningen men ikke akkumulering 7, 18 ved anvendelse chloroquin til at blokere fusion med lysosomer følgelig blokerer co-lokalisering af receptor med lysosomer 2, 5, 6, 7, 18, ved anvendelse af positive kontroller såsom målretning af mærket Ang II til lysosomer 2, og ved sammenligning med andre godt -described receptor og ligand systemer såsom transferrin eller epidermal vækstfaktor og deres beslægtede receptorer 3. En interessant positiv kontrol, enlbeit kulturgenstandsspor, i vore forsøg var et resultat observeret i tilstødende, utransficerede, AT 1a R-GFP-negative celler. Disse celler tilsyneladende tog GFP frigivet fra transficerede celler og målrettet det til lysosomer, hvor co-lokalisering med fluorescerende farvestof var ganske fremtrædende (ikke vist). Denne colokalisering var imidlertid ikke følsom over for Ang II som forventet.
Afslutningsvis fremgangsmåderne til transfektion, billedbehandling og billedanalyse præsenteret her tilvejebringer et middel, hvormed receptorinternalisering til forskellige subcellulære afsnit kan kvantitativt spores i levende celler over tid. Relative sammenligninger mellem forskellige receptorer eller selektivt muterede receptorer er muligt med hensyn til kinetik og subcellulære lokalisering til bestemte rum. Eventuelle vanskeligheder og artefakter der er forbundet med denne teknologi er diskuteret. Ikke desto mindre kan hurtigt levende billeddannelse i 3D kombineret med billedanalyse anvendes til at måle receptor-optagelse og hurtigovergange gennem cytoplasmaet til molekylært definerbare rum. Dette sætter scenen for måling af forskelle skyldes mutation af receptoren eller anvendelsen af agonister, antagonister og inhibitorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forskningen arbejde præsenteres i dette manuskript blev støttet af tilskud R01 HL121456-01A1 til Kathryn Sandberg. Dette arbejde blev støttet ud af tilgængeligheden af en Leica SP8 AOB'er i og Billeddannelse Shared Resource (MISR) ved Georgetown University Medical Center, som er delvist finansieret af P30-CA051008 fra National Institutes of Health i USA. Vi takker Leica SP8 imaging assistance af Peter Johnson, og brugen af Zeiss LSM880 i laboratoriet af Thomas Coate, Biologisk Institut ved Georgetown University med imaging bistand fra Alma Arnold Carl Zeiss Microscopy LLC. Indholdet i dette manuskript er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 - 12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10x | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1x) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
