小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ
Summary
私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。
Abstract
ハイスループットスクリーニング（HTS）は、現在、生化学的反応または細胞プロセスを調節することができる化学物質を同定するための主力です。バイオテクノロジーの進歩と小分子の高い翻訳電位を、薬物発見における革新的なアプローチの数はHTSの使用で復活関心を説明している、進化してきました。癌領域は、移植関連合併症または自己免疫疾患を標的とする新たな免疫調節化合物の同定のために作られていない大きな突破口と、現在、薬物スクリーニングのための最も活発な研究領域です。ここでは、簡単に新しい免疫調節化合物の同定のために適合さビトロネズミ蛍光ベースのリンパ球アッセイで小説を提示します。このアッセイは、Nur77プロモーターはT-又はB-細胞受容体刺激によりGFPの発現を駆動するトランスジェニックマウス由来のTまたはB細胞を使用します。 GFP強度が反映されるように標的細胞の活性化/転写活性は、我々のアッセイは、細胞/生物学的応答に与えられた化合物（複数可）の効果を研究するための新たなツールを定義します。例えば、一次スクリーニングは、免疫調節活性を表示160の潜在的なヒットの同定につながった「標的仮説」の非存在下で4,398の化合物を用いて行きました。したがって、このアッセイの使用は、インビトロ / インビボ検証研究を進める前に、大きな化学ライブラリーを探索する創薬プログラムに適しています。
Introduction
ハイスループットスクリーニング（HTS）が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4（DPP-4）阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 3、4、5、6はまた、HTSは、現在によるカスタム設計された柔軟なロボットのインストール、新規読み出し技術と豊富な小型化などの近年の重要な技術の変換に速いペースで行うことができます。表現型スクリーニング（別名前方薬理学）の使用への関心の高まりに貢献する因子のうち2、 図7は、分子標的（ターゲットベースのスクリーニング/生化学反応）に関する機能的効果ではなく、単純化還元主義の前提に焦点を当てることより可能性があるという認識であります笙へワット臨床効果。このように、表現型スクリーニングは、新しい潜在的な治療化合物と、現在治療不可能な疾患の分子経路を明らかにする可能性を秘めています。 2
適切に与えられた分子標的または細胞の機能のための阻害剤または活性化因子を同定するために、高感度で信頼性のアッセイは、 善意のヒットと偽陽性を区別するために必要とされます。だから、何が良いアッセイを作りますか？所与のアッセイの品質は最初の（Z因子を介して反射された）信号対雑音比によって判断されなければなりません。 8第二に、ターゲットを絞った効果や画面の目標は明確に確立されるべきです。具体的には、リガンド – 受容体結合を評価するために設計されたアッセイとは対照的に、例えば、機能的細胞ベースのアプローチは、受容体のスクリーニングのための重要な利点を提供することができます。この理由は、後者のアプローチは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドを区別することはできませんということです。SS =「外部参照」とは対照的に>図9は、細胞ベースのアプローチは、受容体機能を直接生物学的表現型を評価することができるように、より効果的である可能性が高い（増殖、細胞周期停止、アポトーシス、および/または分化）。しかし、彼らが特定の細胞内標的を侵害するような生化学的アッセイは、表現型アッセイよりも有意な利点を提供することができることに留意しなければなりません。その後、アクションの薬剤分子機構に関連する調査を簡略化しながら十分に最適化生化学的アッセイは、一般的に表現型スクリーニング未満のデータの散布を持つことになります。しかし、ターゲットベースまたは生化学アッセイの主な欠点は、生物学的システム（もともと生化学アッセイにおいて研究特異性の喪失）で試験した場合、非特異的な標的に影響を与える可能性があり、偽陽性ヒットの速度を増幅する可能性があります。 10負と正のヒットの間で十分に確立されたカットオフポイントは、偽陽性の数を最小限に抑えることができますが、私nは一次スクリーニングは、無傷の細胞、全組織または動物全体としてネイティブの細胞環境を模倣する生理学的に関連するシステムの使用は、アッセイデザイン振り子のコアのまま。したがって、表現型スクリーニングは、化合物の活性または作用様式の予備知識がなくても、無識別された薬剤標的を伴う疾患のために望ましい/生物学的表現型効果を持つ鉛の発見を可能にします。 11
市販のマウスモデルおよび化学化合物のクラスタ化されたサブファミリ：本明細書中での研究は、2つの重要なコンポーネントに基づいて最適化され、再現性の表現型スクリーニングの開発とテストに関するものです。動物モデルに関しては、アッセイは、 緑色蛍光タンパク質 （GFP）の発現は第によって駆動されるマウス系統（Nur77 GFP）カセットを含む細菌人工染色体を保有由来するリンパ球の使用に依存します電子Nur77プロモーター。 12この刺激の特徴は、Nur77は、T細胞受容体（TCR）またはB細胞受容体（BCR）刺激後にアップレギュレート前初期遺伝子であるという事実に基づいています。スクリーニング方法自体については、図12に示すように 、アプローチは、大規模な化学ライブラリー（> 10 5の化合物）を評価するために必要な時間を最小限に抑えながら、些細な類似体のスクリーニングを回避するのを助けるために使用しました。そうするために、バーチャルスクリーニングツールを使用して、医薬化学者によって選択された化合物のデータベースを参考として知られている活性種の構造を使用して位相的に類似する化合物を同定するために利用されました。このアプローチは、私たちは136,000を超える化学物質の総合的なライブラリを表す4398化合物をスクリーニングすることができました。
Protocol
Representative Results
Discussion
いくつかの読み出し方法は、高感度で信頼性の高いHTSアッセイの開発のために利用されています。これらは、比色、発光または蛍光方法が挙げられます。比色法は、アップを設定するのは簡単ですが、それらは、細胞が試験されている妨害または破壊し得る化学物質の複数回添加を必要とします。薬理効果は、特定のエンドポイントで評価されるように23加えて、彼らは生?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、モントリオール大学が提供するメルクFrosstスタートアップ資金によってサポートされていました。我々は彼らの議論、コメントやフィードバックのための免疫学および癌における研究所でのハイスループットプラットフォームから博士ジャンDuchaineとドミニクSaloisに感謝したいと思います。 Moutih Rafeiは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEエンサンテケベックジュニア1賞を保持しています。
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
