A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules
Summary
Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.
Abstract
Le criblage à haut-débit (HTS) est actuellement le pilier pour l'identification des entités chimiques capables de moduler les réactions biochimiques ou processus cellulaires. Avec l'avancement des biotechnologies et le potentiel translationnelle élevé de petites molécules, un certain nombre d'approches novatrices dans la découverte de médicaments ont évolué, ce qui explique le regain d'intérêt dans l'utilisation des HTS. Le domaine de l'oncologie est actuellement la zone la plus active de recherche pour le dépistage des drogues, sans percée majeure faite pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs ciblant les complications liées à la transplantation ou d'affections auto-immunes,. Ici, nous présentons un roman dans le test murin in vitro des lymphocytes fluorescents à base facilement adapté pour l'identification de nouveaux composés immunomodulateurs. Cet essai utilise des cellules T ou B dérivées d'une souris transgénique dans laquelle le promoteur conduit l'expression Nur77 GFP sur T- ou la stimulation du récepteur des lymphocytes B. Comme l'intensité de la GFP reflète laactivation / activité transcriptionnelle de la cellule cible, notre test définit un nouvel outil pour étudier l'effet du composé (s) donnée sur les réponses cellulaires / biologiques. Par exemple, un criblage primaire a été réalisée en utilisant 4,398 composés en l'absence d'une "hypothèse cible", qui a conduit à l'identification de 160 résultats potentiels présentant des activités immunomodulatrices. Ainsi, l'utilisation de ce test est approprié pour les programmes de découverte de médicaments explorant de grandes bibliothèques chimiques avant de poursuivre des études in vitro / in vivo de validation.
Introduction
criblage à haut débit (HTS) est une stratégie éprouvée largement adoptée pour l'identification de nouvelles molécules thérapeutiques ou pour le repositionnement de médicaments approuvés par la FDA dans de nouvelles indications médicales. 1 Jusqu'à présent, le succès HTS obtenu peut être mesurée par la pléthore de médicaments précédemment découverts. Par exemple, l'inhibiteur de tyrosine-kinase lapatinib utilisé pour le traitement du cancer du sein, la sitagliptine; une dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4), l'inhibiteur utilisé comme un médicament anti-hyperglycémique, et la Bcr-Abl inhibiteur de tyrosine kinase dasatinib oral pour le traitement de la leucémie myéloïde chronique représentent quelques exemples d'une liste de médicaments approuvés initialement découverts par HTS. 2 Bien que la productivité de l'industrie pharmaceutique a récemment souffert d'un manque dans la découverte de nouvelles entités chimiques, la probabilité de découverte de médicaments réussie peut être améliorée grâce à une augmentation du nombre de candida pré-cliniquetes présentant des propriétés biologiques / biochimiques modulateurs. En conséquence, le développement de nouveaux tests HTS adaptés pour le criblage phénotypique pourrait offrir le potentiel de fournir des outils pharmacologiques importants pour la découverte de nouveaux hits de drogue. 3, 4, 5, 6 En outre, HTS peuvent maintenant être effectuées à un rythme plus rapide en raison de transformations technologiques importantes au cours des dernières années , y compris les installations sur mesure flexibles robotiques, de nouvelles technologies de lecture et une miniaturisation poussée. 2, 7 Parmi les facteurs qui contribuent à l'intérêt croissant pour l'utilisation du dépistage phénotypique (aka l' avant de la pharmacologie) est la perception qu'en se concentrant sur les effets fonctionnels plutôt que des hypothèses réductionnistes simplificatrices concernant les cibles moléculaires (dépistage / réactions biochimiques par objectifs) est plus probable sho efficacité clinique w. Ainsi, le dépistage phénotypique tient la promesse de découvrir de nouveaux composés potentiellement thérapeutiques et les voies moléculaires des maladies actuellement incurables. 2
Pour bien identifier des inhibiteurs ou activateurs pour une cible moléculaire donnée ou la fonction cellulaire, un dosage très sensible et fiable est nécessaire pour faire la différence entre succès de bonne foi et de faux positifs. Donc, ce qui fait un bon dosage? La qualité d'un dosage donné doit être jugé par le premier rapport signal-sur-bruit (par un facteur réfléchi Z). 8 Deuxièmement, l'effet ciblé ou le but de l'écran doivent être clairement établies. Par exemple, les approches basées sur les cellules fonctionnelles peuvent offrir des avantages significatifs pour le dépistage du récepteur par rapport à un essai spécialement conçu pour évaluer la liaison du ligand-récepteur. La raison pour cela est que cette dernière approche ne peut pas différencier entre les ligands agonistes et antagonistes.ss = "référence externe"> 9 En revanche, une approche basée sur des cellules est susceptible d'être plus efficace que la fonction du récepteur peut être évalué directement en un phénotype biologique (prolifération, arrêt du cycle cellulaire, l' apoptose et / ou la différenciation). Cependant, il faut noter que les tests biochimiques peuvent fournir des avantages significatifs par rapport aux essais phénotypiques car ils empiètent sur une cible intracellulaire spécifique. Un dosage biochimique bien optimisé aura généralement moins de dispersion de données qu'un dépistage phénotypique tout en simplifiant la suite des enquêtes relatives au mécanisme moléculaire de la drogue de l'action. Cependant, l'inconvénient majeur de tests d'objectifs ou biochimiques est le risque d'amplifier le taux de résultats faussement positifs qui peuvent influer sur les cibles non spécifiques lorsqu'il est testé dans un système biologique (perte de la spécificité étudiée à l'origine dans le dosage biochimique). 10 Bien que d' un point de coupure bien établie entre résultats négatifs et positifs peut réduire le nombre de faux positifs in le criblage primaire, l'utilisation d'un système physiologiquement pertinent mimant l'environnement cellulaire natif telles que des cellules intactes, des tissus entiers ou animal entier reste le noyau du pendule de la conception de l'essai. Par conséquent, le dépistage phénotypique permet la découverte de plomb avec des effets phénotypiques biologiques / souhaitables pour les maladies sans cibles de médicaments identifiés sans avoir une connaissance préalable de l'activité du composé ou le mode d'action. 11
L'étude de ce document concerne le développement et le test d'un dépistage phénotypique optimisé et reproductible sur la base de deux éléments importants: un modèle de souris disponible dans le commerce et une sous-famille cluster de composés chimiques. En ce qui concerne le modèle animal, le test repose sur l'utilisation de lymphocytes provenant d'une souche de souris (Nur77 GFP) hébergeant un chromosome artificiel bactérien contenant une cassette dans laquelle l'expression de la protéine fluorescente verte (GFP) est entraîné par epromoteur e Nur77. 12 La caractéristique de cette stimulation est basée sur le fait que Nur77 est un gène précoce immédiat régulée à la hausse suivant récepteur des lymphocytes T (TCR) ou un récepteur de lymphocyte B (BCR) de stimulation. 12 En ce qui concerne la méthode de dépistage lui – même, une approche a été utilisée pour aider à éviter la projection d'analogues triviales tout en minimisant le temps nécessaire pour évaluer une grande bibliothèque chimique (> 10 5 composés). Pour ce faire, une base de données de composés chimiques sélectionnés par les chimistes médicinaux en utilisant des outils de criblage virtuel a été exploitée pour identifier des composés topologiquement similaires en utilisant des structures de semences actives connues comme des références. Cette approche nous a permis de cribler 4,398 composés représentant une bibliothèque globale de plus de 136.000 entités chimiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Plusieurs méthodes de lecture ont été exploitée pour le développement des sensibles et fiables HTS. Ceux-ci comprennent colorimétriques, luminescents ou fluorescents méthodes. Bien que les méthodes colorimétriques sont simples à mettre en place, ils nécessitent plusieurs ajouts de produits chimiques qui peuvent interférer ou perturber les cellules testées. 23 En outre, ils ne permettent pas une évaluation dynamique d'une réponse biologique comme l'effet pharmacologique est …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les fonds Merck Frosst Start-up fournis par l'Université de Montréal. Nous tenons à remercier les Drs Jean Duchaine et Dominic Salois de la plate-forme à haut débit à l'Institut de recherche en immunologie et en cancérologie pour leurs discussions, commentaires et évaluations. Moutih Rafei est titulaire d'un Fonds de la Recherche en Santé du Québec 1 Prix junior.
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
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