Summary

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Published: March 10, 2017
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Summary

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Abstract

el cribado de alto rendimiento (HTS) es actualmente el pilar para la identificación de entidades químicas capaces de modular las reacciones bioquímicas o procesos celulares. Con el avance de la biotecnología y el alto potencial de traslación de moléculas pequeñas, una serie de enfoques innovadores en el descubrimiento de fármacos han evolucionado, lo que explica el resurgimiento del interés en el uso de HTS. El campo de la oncología es actualmente el área de investigación más activo para la detección de drogas, sin gran avance realizado para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores de orientación complicaciones relacionadas con el trasplante o enfermedades autoinmunes. A continuación, presentamos una novela de ensayo de linfocitos a base de fluorescentes murino in vitro puede adaptar fácilmente para la identificación de nuevos compuestos inmunomoduladores. Este ensayo utiliza células T o B derivadas de un ratón transgénico, en la que el promotor dirige la expresión Nur77 GFP en T o en la estimulación del receptor de células B. A medida que la intensidad refleja la GFPactivación / actividad transcripcional de la célula diana, nuestro ensayo define una nueva herramienta para estudiar el efecto del compuesto (s) dada en las respuestas celulares / biológicos. Por ejemplo, un cribado primario se realizó con 4.398 compuestos en ausencia de una "hipótesis objetivo", lo que llevó a la identificación de 160 éxitos potenciales que muestran actividades inmunomoduladoras. Por lo tanto, el uso de este ensayo es adecuado para los programas de descubrimiento de fármacos explorando grandes bibliotecas químicas antes de continuar los estudios de validación in vitro / in vivo.

Introduction

cribado de alto rendimiento (HTS) es una estrategia probada ampliamente adoptado para la identificación de nuevas moléculas terapéuticas o para el reposicionamiento de fármacos aprobados por la FDA en nuevas indicaciones médicas. 1 Hasta ahora, el éxito alcanzado HTS se puede medir por la gran cantidad de medicamentos descubiertos con anterioridad. Por ejemplo, el inhibidor de tirosina quinasa lapatinib utiliza para el tratamiento de cáncer de mama, la sitagliptina; una dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) inhibidor utilizado como un fármaco anti-hiperglucémico, y el dasatinib por vía oral inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl se utiliza para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica representan algunos ejemplos de una larga lista de medicamentos aprobados originalmente descubierto por HTS. 2 Aunque la productividad de la industria farmacéutica ha sufrido últimamente de una falta en el descubrimiento de nuevas entidades químicas, la probabilidad de descubrimiento de fármacos con éxito se puede mejorar a través de un aumento en el número de candida pre-clínicates que exhiben propiedades biológicas / bioquímicas moduladores. En consecuencia, el desarrollo de nuevos ensayos de HTS adaptados para el cribado fenotípico podría ofrecer el potencial de proporcionar importantes herramientas farmacológicas para el descubrimiento de nuevos éxitos de drogas. 3, 4, 5, 6 Además, HTS ahora pueden llevarse a cabo a un ritmo más rápido debido a las transformaciones tecnológicas importantes en los últimos años, incluyendo instalaciones de diseño personalizado flexibles, nuevas tecnologías robóticas Lectura y extensa miniaturización. 2, 7 Entre los factores que contribuyen a la creciente interés en el uso de la detección fenotípica (aka hacia adelante farmacología) es la percepción de que se centra en los efectos funcionales en lugar de supuestos reduccionistas simplistas con respecto a dianas moleculares (detección / reacciones bioquímicas por objetivos) es más probable sho eficacia clínica w. Por lo tanto, el cribado fenotípico mantiene la promesa de descubrir nuevos compuestos potencialmente terapéuticos y vías moleculares de las enfermedades actualmente incurables. 2

Para identificar correctamente inhibidores o activadores para una diana molecular dada o la función celular, se requiere un ensayo altamente sensible y fiable con el fin de diferenciar entre los accesos de buena fe y falsos positivos. Por lo tanto, lo que hace un buen ensayo? La calidad de un ensayo dado debe ser primero juzgado por la relación de señal a ruido (que se refleja a través de un factor Z). 8 En segundo lugar, el efecto específico o el objetivo de la pantalla deben estar claramente establecidas. Por ejemplo, los enfoques basados ​​en células funcionales pueden ofrecer ventajas significativas para la detección del receptor en lugar de un ensayo diseñado específicamente para evaluar la unión del ligando-receptor. La razón de esto es que el último enfoque no puede diferenciar entre ligandos agonistas y antagonistas.ss = "xref"> 9 En contraste, un enfoque basado en la célula es probable que sea más eficaz como la función del receptor puede ser evaluada directamente en un fenotipo biológico (proliferación, la detención del ciclo celular, apoptosis, y / o diferenciación). Sin embargo, hay que señalar que los ensayos bioquímicos pueden proporcionar ventajas significativas sobre ensayos fenotípicos, ya que infringen una diana intracelular específica. Un ensayo bioquímico bien optimizado en general, tendrá menos dispersión de datos que un cribado fenotípico al tiempo que simplifica posteriormente las investigaciones relacionadas con el mecanismo molecular de acción de drogas. Sin embargo, el principal inconveniente de los ensayos basados ​​en diana o bioquímicos es la posibilidad de amplificar la tasa de falsos positivos hits que pueden afectar a los objetivos no específicos cuando se prueba en un sistema biológico (pérdida de la especificidad estudiado originalmente en el ensayo bioquímico). 10 Aunque un punto de corte bien establecida entre los accesos negativos y positivos puede minimizar el número de falsos positivos in el cribado primario, el uso de un sistema fisiológicamente relevante imitando el ambiente celular nativo, como células intactas, todo el tejido o animal conjunto sigue siendo el núcleo del péndulo diseño de ensayo. Por lo tanto, el cribado fenotípico permite el descubrimiento de cabezas con efectos fenotípicos biológicos / deseables para las enfermedades que no tienen objetivos de medicamentos identificados sin tener conocimiento previo de la actividad o modo de acción del compuesto. 11

El estudio en el presente documento se refiere al desarrollo y ensayo de un cribado fenotípico optimizado y reproducible basado en dos componentes importantes: un modelo de ratón comercialmente disponible y un clúster sub-familia de compuestos químicos. Con respecto al modelo animal, el ensayo se basa en el uso de los linfocitos derivados de una cepa de ratón (Nur77 GFP) que alberga un cromosoma artificial bacteriano que contiene un casete en el que la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) es conducido por THpromotor e Nur77. 12 La característica distintiva de esta estimulación se basa en el hecho de que Nur77 es un gen temprano inmediato hasta reguladas siguiente receptor de células T (TCR) o la estimulación del receptor de células B (BCR). 12 En cuanto al método de detección en sí, se utilizó un enfoque para ayudar a evitar la detección de análogos triviales y reducir al mínimo el tiempo necesario para evaluar una gran biblioteca química (> 10 5 compuestos). Para ello, una base de datos de compuestos químicos seleccionados por los químicos medicinales que utilizan herramientas de cribado virtual fue explotada para identificar compuestos topológicamente similares utilizando estructuras de semillas activas conocidas como referencias. Este enfoque nos ha permitido a la pantalla de 4.398 compuestos que representan una biblioteca global de más de 136.000 entidades químicas.

Protocol

Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad de Montreal. Los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO 2 gradual hasta que no se observaron signos vitales seguido por dislocación cervical. El procedimiento se llevó a cabo por una persona certificada para garantizar que los animales fueron sacrificados de manera humanitaria y de acuerdo con las recomendaciones del Consejo Canadiense de Protección de los Animales. 1…

Representative Results

Diseño del ensayo HTS Dos factores importantes fueron tomadas en cuenta al diseñar el ensayo en el presente documento fluorescente. En primer lugar, tuvimos que repetir una condición fisiológica en la que la activación de células T o B representaría una enfermedad (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped). En segundo lugar, la evaluación de la activación celular debe ser realizada utilizando un métod…

Discussion

Varios métodos de lectura de salida se han explotado para el desarrollo de ensayos de HTS sensibles y fiables. Estos incluyen colorimétrica, luminiscente o métodos fluorescentes. Aunque los métodos colorimétricos son simples de configuración, se requieren múltiples adiciones de productos químicos, que pueden interferir o interrumpir las células que están siendo probados. 23 Además, no permiten la evaluación dinámica de una respuesta biológica tal como el efecto farmacológico se eva…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por los fondos de Merck Frosst puesta en marcha ofrecidas por la Universidad de Montreal. Nos gustaría dar las gracias a los doctores Jean Duchaine y Dominic Salois desde la plataforma de alto rendimiento en el Instituto de Investigación en Inmunología y Cáncer para su discusión, observaciones y evaluaciones. Moutih Rafei mantiene a la Recherche en Santé du Québec Premio 1 Fonds de Junior.

Materials

Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomed FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 hours incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

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Cite This Article
Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

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