Summary

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています。

Abstract

ハイスループットスクリーニング(HTS)は、現在、生化学的反応または細胞プロセスを調節することができる化学物質を同定するための主力です。バイオテクノロジーの進歩と小分子の高い翻訳電位を、薬物発見における革新的なアプローチの数はHTSの使用で復活関心を説明している、進化してきました。癌領域は、移植関連合併症または自己免疫疾患を標的とする新たな免疫調節化合物の同定のために作られていない大きな突破口と、現在、薬物スクリーニングのための最も活発な研究領域です。ここでは、簡単に新しい免疫調節化合物の同定のために適合さビトロネズミ蛍光ベースのリンパ球アッセイ小説を提示します。このアッセイは、Nur77プロモーターはT-又はB-細胞受容体刺激によりGFPの発現を駆動するトランスジェニックマウス由来のTまたはB細胞を使用します。 GFP強度が反映されるように標的細胞の活性化/転写活性は、我々のアッセイは、細胞/生物学的応答に与えられた化合物(複数可)の効果を研究するための新たなツールを定義します。例えば、一次スクリーニングは、免疫調節活性を表示160の潜在的なヒットの同定につながった「標的仮説」の非存在下で4,398の化合物を用いて行きました。したがって、このアッセイの使用は、インビトロ / インビボ検証研究を進める前に、大きな化学ライブラリーを探索する創薬プログラムに適しています。

Introduction

ハイスループットスクリーニング(HTS)が広く新しい治療分子の同定のため、または新しい医学的適応症におけるFDA承認薬物の再配置のために採用実績のある戦略です。 1はこれまでのところ、達成HTSの成功は、以前に発見された薬の茄多によって測定することができます。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブは、乳癌、シタグリプチンの治療のために使用されます。ジペプチジルペプチダーゼ-4(DPP-4)阻害剤、抗高血糖薬として使用され、慢性骨髄性白血病の治療のために使用される経口BCR-ABLチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブは、もともとによって発見され承認された薬物の長いリストのいくつかの例を表していますHTS。製薬業界の生産は最近、新しい化学物質の発見で不足に苦しんできたが2、成功した薬剤の発見の可能性が前臨床カンジダの数の増加によって改善することができます調節生物学/生化学的特性を表示するTES。したがって、表現型スクリーニングのために適合新しいHTSアッセイの開発は、新薬のヒットの発見のために重要な薬理学的なツールを提供する可能性を提供することができます。 3、4、5、6また、HTSは、現在によるカスタム設計された柔軟なロボットのインストール、新規読み出し技術と豊富な小型化などの近年の重要な技術の変換に速いペースで行うことができます。表現型スクリーニング(別名前方薬理学)の使用への関心の高まりに貢献する因子のうち2、 図7は、分子標的(ターゲットベースのスクリーニング/生化学反応)に関する機能的効果ではなく、単純化還元主義の前提に焦点を当てることより可能性があるという認識であります笙へワット臨床効果。このように、表現型スクリーニングは、新しい潜在的な治療化合物と、現在治療不可能な疾患の分子経路を明らかにする可能性を秘めています。 2

適切に与えられた分子標的または細胞の機能のための阻害剤または活性化因子を同定するために、高感度で信頼性のアッセイは、 善意のヒットと偽陽性を区別するために必要とされます。だから、何が良いアッセイを作りますか?所与のアッセイの品質は最初の(Z因子を介して反射された)信号対雑音比によって判断されなければなりません。 8第二に、ターゲットを絞った効果や画面の目標は明確に確立されるべきです。具体的には、リガンド – 受容体結合を評価するために設計されたアッセイとは対照的に、例えば、機能的細胞ベースのアプローチは、受容体のスクリーニングのための重要な利点を提供することができます。この理由は、後者のアプローチは、アゴニストおよびアンタゴニストリガンドを区別することはできませんということです。SS =「外部参照」とは対照的に>図9は、細胞ベースのアプローチは、受容体機能を直接生物学的表現型を評価することができるように、より効果的である可能性が高い(増殖、細胞周期停止、アポトーシス、および/または分化)。しかし、彼らが特定の細胞内標的を侵害するような生化学的アッセイは、表現型アッセイよりも有意な利点を提供することができることに留意しなければなりません。その後、アクションの薬剤分子機構に関連する調査を簡略化しながら十分に最適化生化学的アッセイは、一般的に表現型スクリーニング未満のデータの散布を持つことになります。しかし、ターゲットベースまたは生化学アッセイの主な欠点は、生物学的システム(もともと生化学アッセイにおいて研究特異性の喪失)で試験した場合、非特異的な標的に影響を与える可能性があり、偽陽性ヒットの速度を増幅する可能性があります。 10負と正のヒットの間で十分に確立されたカットオフポイントは、偽陽性の数を最小限に抑えることができますが、私nは一次スクリーニングは、無傷の細胞、全組織または動物全体としてネイティブの細胞環境を模倣する生理学的に関連するシステムの使用は、アッセイデザイン振り子のコアのまま。したがって、表現型スクリーニングは、化合物の活性または作用様式の予備知識がなくても、無識別された薬剤標的を伴う疾患のために望ましい/生物学的表現型効果を持つ鉛の発見を可能にします。 11

市販のマウスモデルおよび化学化合物のクラスタ化されたサブファミリ:本明細書中での研究は、2つの重要なコンポーネントに基づいて最適化され、再現性の表現型スクリーニングの開発とテストに関するものです。動物モデルに関しては、アッセイは、 緑色蛍光タンパク質 (GFP)の発現は第によって駆動されるマウス系統(Nur77 GFP)カセットを含む細菌人工染色体を保有由来するリンパ球の使用に依存します電子Nur77プロモーター。 12この刺激の特徴は、Nur77は、T細胞受容体(TCR)またはB細胞受容体(BCR)刺激後にアップレギュレート前初期遺伝子であるという事実に基づいています。スクリーニング方法自体については、図12に示すように 、アプローチは、大規模な化学ライブラリー(> 10 5の化合物)を評価するために必要な時間を最小限に抑えながら、些細な類似体のスクリーニングを回避するのを助けるために使用しました。そうするために、バーチャルスクリーニングツールを使用して、医薬化学者によって選択された化合物のデータベースを参考として知られている活性種の構造を使用して位相的に類似する化合物を同定するために利用されました。このアプローチは、私たちは136,000を超える化学物質の総合的なライブラリを表す4398化合物をスクリーニングすることができました。

Protocol

全ての動物プロトコルはモントリオール大学の動物実験委員会によって承認されました。何のバイタルサインが頸椎脱臼に続いて観察されなくなるまで、マウスをCO 2の緩やかな吸入によって安楽死させました。手順は、動物を人道的方法で安楽死させ、動物ケアに関するカナダ評議会の勧告に従ってたことを確認するために、認定者によって行われました。 脾細?…

Representative Results

HTSアッセイの設計本明細書中で蛍光アッセイを設計するときに、2つの重要な要素は、考慮されました。まず、T-またはB細胞の活性化は、病気( 例えば 、移植片対宿主病)を表すことになるで生理学的状態を再現する必要がありました。第二に、細胞活性化の評価は、高感度で定量的な方法を用いて行うべきです。?…

Discussion

いくつかの読み出し方法は、高感度で信頼性の高いHTSアッセイの開発のために利用されています。これらは、比色、発光または蛍光方法が挙げられます。比色法は、アップを設定するのは簡単ですが、それらは、細胞が試験されている妨害または破壊し得る化学物質の複数回添加を必要とします。薬理効果は、特定のエンドポイントで評価されるように23加えて、彼らは生?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、モントリオール大学が提供するメルクFrosstスタートアップ資金によってサポートされていました。我々は彼らの議論、コメントやフィードバックのための免疫学および癌における研究所でのハイスループットプラットフォームから博士ジャンDuchaineとドミニクSaloisに感謝したいと思います。 Moutih Rafeiは、フォン・ド・ラ・RECHERCHEエンサンテケベックジュニア1賞を保持しています。

Materials

Nur77GFP mice The Jackson Laboratory Mouse strain No. 016617 An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterile VWR International 10062-902 T-cell activation using the magnetic beads
70µm cell strainer, sterile Corning Inc. 352350 Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile Corning Inc. 352058 Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile VWR International 89039-656  Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterile Becton, Dickinson and Company 305482 To mash the spleen
T-25 culture flask Greiner Bio-One 690 175 To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterile Greiner Bio-One 627 160 To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) WISENT Inc. 450-200-EL   Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine WISENT Inc. 350-002-CL  Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acids WISENT Inc. 321-010-EL  Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 M WISENT Inc. 330-050-EL  Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM) WISENT Inc. 600-110-EL  Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS)  WISENT Inc. 080-910  Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS) WISENT Inc. 311-010-CL Component of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023 Component of the splenocyte media
T- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19851 To isolate T cells
B- Cells isolation kit Stemcell Technologies 19854 To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads Thermo Fisher Scientific 11452D To activate T cells 
Cell isolation magnet Stemcell Technologies 18000 To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 115-006-068 To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7 Peprotech 217-17  To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40L R&D Systems 8230-CL/CF To stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibody BD Pharmingen 561799 To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibody BD Pharmingen 553786 To stain B cells for flow-cytometry
Biomed FXp PerkinElmer Inc. A31842 To re-suspend cells after 24 hours incubation
Opera Phenix High Content Screening System PerkinElmer Inc. HH14000000 To analyze GFP/Hoechst signal

References

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Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp. (121), e55199, doi:10.3791/55199 (2017).

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