Summary

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Abstract

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Introduction

التحديد الصحيح للنوى cardiomyocyte ووضع دورة الخلية هي ذات أهمية حاسمة لتحديد قيمة التداول عضلة القلب والتجدد. هذا ينطبق بشكل خاص على استخدام علامات النووية، مثل pHH3، كي-67، أو النظير ثيميدين، لتحديد النشاط دورة الخلية هذا. كما أن قدرة التكاثري العضلية الثدييات الكبار صغيرة جدا هوية مزورة من نواة إيجابية لعلامة انتشار نواة cardiomyocyte يمكن أن تحدث فرقا حاسما في نتائج فحص انتشار الأسلحة النووية. وعلاوة على ذلك، العضلية عرضة للتغيرات في دورة الخلية، مثل تنسخ داخلي والانقسام acytokinetic، مما يؤدي في الخلايا المتعددة الصبغيات ومتعددة النوى وليس في انقسام الخلايا. تحقيقا لهذه الغاية، تفسير تلوين الأجسام المضادة ضد علامات دورة الخلية المشتركة ليست قاطعة في جميع الحالات.

هنا، فإننا نقدم طرق ل-forwa على التوالي اعتراف طريق الخلايا العضلية الماوس وnuclearity في الخلايا المعزولة المحلية وأقسام الأنسجة السميكة على بعد الولادة وتعليم الكبار مراحل من تحديد لا لبس فيه من النواة. لهذا الغرض، تم استخدام خط الماوس المعدلة وراثيا مع التعبير عن cardiomyocyte معين من البروتين الانصهار تتكون من H2B هيستون البشري وmCherry تحت سيطرة المروج Myh6 (Myh6-H2B-صحة الأم والطفل) 2. التهجين هذا الخط الفأر مع خط الماوس مؤشر انتشار المعدلة وراثيا، والتي التعبير عن بروتين الانصهار EGFP-anillin تحت السيطرة في كل مكان المروج الأكتين الدجاج مع محسن CMV (CAG-EGFP-anillin)، يسمح لل تحديد الوضع دورة الخلية. وأعرب anillin البروتين السقالات على وجه التحديد في الخلية دورة الخلية النشطة والتفضيلية توطين التحت خلوية لها خلال دورة الخلية يسمح ليعيش تتبع تقدم دورة الخلية مع دقة عالية من M-المرحلةEF "> 4. ولذلك، فإن الفئران المعدلة وراثيا مزدوج يمكن استخدامها للتمييز بين المتكاثرة العضلية وتلك التي تخضع لتغيرات دورة الخلية. وهذا يثبت مفيدة بشكل خاص في الكشف عن المواد يحفز تكاثر في المختبر.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات من هذا البروتوكول تنطوي على الحيوانات وفقا للمعايير الأخلاقية من جامعة بون وامتثلت للمبادئ التوجيهية من التوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي والبرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض علمية. 1. في…

Representative Results

من أجل تحليل آثار الرناوات siRNAs / miRNAs على النشاط دورة الخلية العضلية بعد الولادة في المختبر، العضلية من ضعف المعدلة وراثيا الفئران Myh6-H2B-صحة الأم والطفل / CAG-EGFP-anillin تم عزل في يوم ما بعد الولادة 3 (P3) وtransfected مع النشاط الذي يحفز دورة الخلية miR199 <sup class="x…

Discussion

هناك جدل حول ما اذا العضلية قادرة على إعادة إدخال دورة الخلية وتقسيم بعد الاصابه وخلال توازن الأنسجة. وقد تم إعطاء القيم لدوران الأساسي العضلية في نطاق بين 1٪ 1 و 80٪ 7. أيضا بعد الآفة القلبية، وقد تم الإبلاغ عن تحريض النشاط دورة الخلية وتوليد ا…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.

Materials

10 cm petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 ml syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1mg/ml) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MGCl Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinine (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Play Video

Cite This Article
Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

View Video