Summary

La visualizzazione delle variazioni del ciclo cellulare e la determinazione di nucleazione in postnatali cardiomiociti

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.

Abstract

Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.

Introduction

La corretta identificazione dei nuclei cardiomiociti e lo stato del ciclo cellulare è di cruciale importanza per la determinazione del fatturato muscolo cardiaco e la rigenerazione. Ciò è particolarmente vero per l'uso di marcatori nucleari, come pHH3, Ki-67, o analoghi della timidina, per l'identificazione dell'attività ciclo cellulare. Poiché la capacità proliferativa dei cardiomiociti mammiferi adulti è molto piccolo 1, una falsa identificazione di un nucleo positivo per un marker di proliferazione di un nucleo cardiomiociti potrebbe fare una differenza cruciale nel risultato di un saggio di proliferazione. Inoltre, cardiomiociti sono inclini a variazioni del ciclo cellulare, come endoreduplicazione e mitosi acytokinetic, che determinano cellule poliploidi e multinucleate piuttosto che nella divisione cellulare. A tal fine, l'interpretazione della colorazione anticorpi contro marcatori del ciclo cellulare comuni non è determinante in tutti i casi.

Qui, vi presentiamo i metodi per il diritto-forwa il riconoscimento Rd di cardiomiociti di topo e la loro nuclearità in cellule isolate nativi e sezioni di tessuto di spessore nelle fasi post-natali e adulti dall'identificazione univoca dei loro nuclei. A tal fine, una linea di topi transgenici con espressione specifici cardiomiociti di una proteina di fusione che consiste di H2B istone umano e mCherry sotto il controllo del promotore Myh6 (Myh6-H2B-MCH) è stato usato 2. Incroci questa linea di topi con una linea di topi indicatore di proliferazione transgenico, in cui l'espressione di una proteina di fusione eGFP-anillin è sotto il controllo del onnipresente promotore pollo actina con potenziatore CMV (CAG-eGFP-anillin), consente la determinazione dello stato del ciclo cellulare. Il anillin proteina ponteggio è specificamente indicato nella cellula-ciclo cellulare attivo 3, e il suo differenziale localizzazione subcellulare durante il ciclo cellulare permette per la progressione del ciclo cellulare live-tracciamento con una risoluzione di M-Phaseef "> 4. Pertanto, i topi transgenici doppia può essere utilizzato per discriminare tra cardiomiociti proliferanti e quelli che subiscono variazioni del ciclo cellulare. Questo dimostra particolarmente utile nello screening per sostanze proliferazione di indurre in vitro.

Protocol

Tutte le procedure di questo protocollo che coinvolge gli animali erano in conformità con gli standard etici della Università di Bonn e rispettate le linee guida della direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici. 1. In Vitro visualizzazione di Cell ciclo di attività in postnatale cardiomiociti Postnatale dissociazione cardiomiociti preparazioni pre-sperimentali Preparare terreni di coltura…

Representative Results

Al fine di analizzare gli effetti di siRNA / miRNA sull'attività ciclo cellulare di cardiomiociti post-natale in vitro, cardiomiociti di topi Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doppio transgenici sono stati isolati in postnatale giorno 3 (P3) e transfettate con ciclo cellulare attività che inducono miR199 5, siRNA p27, e siRNA Fzr1. Rispetto al controllo negativo (Figura 1A), le immagini di miR199- (Figura 1B) e siRNA …

Discussion

C'è una polemica sul fatto cardiomiociti sono in grado di rientrare nel ciclo cellulare e dividere dopo l'infortunio e durante l'omeostasi dei tessuti. I valori per il fatturato base dei cardiomiociti hanno ricevuto nell'intervallo tra 1% e 80% 1 7. Anche dopo una lesione cardiaca, l'induzione dell'attività ciclo cellulare e la generazione di nuovi cardiomiociti è stata riportata nella zona di confine, con valori compresi tra 0,0083% <sup class="…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.

Materials

10 cm petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 ml syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1mg/ml) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MGCl Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinine (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

Play Video

Cite This Article
Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

View Video