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Developmental Biology

La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales

Published: February 24, 2017 doi: 10.3791/55204
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Institute of Physiology I, University of Bonn
* These authors contributed equally

Introduction

La correcta identificación de los núcleos de cardiomiocitos y el estado del ciclo celular es de crucial importancia para la determinación del volumen de negocios del músculo cardiaco y la regeneración. Esto es especialmente cierto para el uso de marcadores nucleares, tales como pHH3, Ki-67, o los análogos de timidina, para la identificación de la actividad del ciclo celular. Como la capacidad de proliferación de los cardiomiocitos de mamíferos adultos es muy pequeño 1, una falsa identificación de un núcleo positivo para un marcador de proliferación de un núcleo de cardiomiocitos podría hacer una diferencia crucial en el resultado de un ensayo de proliferación. Además, los cardiomiocitos son propensos a las variaciones en el ciclo celular, tales como la endorreduplicación y la mitosis acytokinetic, que resultan en células poliploides y multinucleadas en lugar de en la división celular. Con este fin, la interpretación de la tinción de anticuerpos contra marcadores del ciclo celular comunes no es concluyente en todos los casos.

A continuación, presentamos los métodos para la recta forwa reconocimiento rd de cardiomiocitos de ratón y su nuclearidad en células aisladas nativas y secciones de tejido de espesor en las etapas postnatales y adultos por la identificación inequívoca de sus núcleos. Para ello, se utilizó una línea de ratones transgénicos con la expresión de los cardiomiocitos-específica de una proteína de fusión que consta de la histona H2B humana y mCherry bajo el control del promotor MYH6 (MYH6-H2B-MCH) 2. Cruzamiento de esta línea de ratón con una línea de ratones indicador de proliferación transgénico, en el que la expresión de una proteína de fusión eGFP-anillin está bajo el control del promotor de actina de pollo ubicua con un promotor de CMV (CAG-eGFP-anillin), permite la determinación del estado del ciclo celular. El anillin andamio de proteínas se expresa específicamente en el ciclo celular de células activas 3, y su localización subcelular diferencial durante el ciclo celular permite la progresión del ciclo celular en vivo de seguimiento con una alta resolución de la fase Mef "> 4. Por lo tanto, los ratones dobles transgénicos pueden ser utilizados para discriminar entre la proliferación de los cardiomiocitos y los que se someten a variaciones del ciclo celular. Esto resulta especialmente útil en el cribado de sustancias que inducen la proliferación in vitro.

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Protocol

Todos los procedimientos de este protocolo se utilicen animales estaban en conformidad con las normas éticas de la Universidad de Bonn y cumplen con las directrices de la Directiva 2010/63 / UE del Parlamento Europeo sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. En Vitro Visualización de actividad del ciclo celular en cardiomiocitos postnatal

  1. la disociación de los cardiomiocitos postnatales
    1. preparaciones pre-experimentales
      1. Preparar los medios de cultivo (IMDM, 1% penicilina / estreptomicina, aminoácidos no esenciales al 1%, 0,1% β-mercaptoetanol); medio 1: añadir FCS al 2%; medio 2: añadir FCS al 20%.
      2. Escudo una placa de cultivo de 96 pocillos (área media-crecimiento: 15 mm 2) con 0,1% de gelatina en solución PBS.
    2. la disección del corazón
      1. Preparar una placa de Petri con 15 ml de PBS y almacenarla en hielo. Esterilizar dos pinzas y tijeras pequeñas, poniéndolos en un esterilizador de cuentas de vidrio seco. Sacrificar los ratones transgénicos neonatal (CAG-eGFP-anillin / MYH6-H2B-MCH) por decapitación. Abrir el tórax, diseccionar el corazón, como se describe en Ehler et al. , 2013 (J .; Exp Vis (79):. 50154 doi: 10.3791 / 50154), y la transfiere a la PBS enfriado con hielo. Pasar a la próxima ratón.
      2. Si el uso de parejas reproductoras no homocigotos, identificar los corazones transgénicos con un microscopio de fluorescencia. Poner el corazón en PBS con un microscopio fluorescente. Compruebe para la expresión eGFP-anillin (Ej .: 488 nm; Em .: 509 nm) y la expresión H2B-MCH (Ej .: 587 nm; Em .: 610 nm) con los conjuntos de filtros apropiados.
    3. el aislamiento de los cardiomiocitos
      1. Disociar el corazón seleccionados utilizando el kit de disociación corazón neonatal. Incubar la mezcla de enzimas 1 a 37 ° C durante 5 min. Para obtener 1 ml de la mezcla de enzima final, añadir 945 l de mezcla de enzimas 1-55 l de mezcla de enzimas 2.
      2. Transferir hasta 4 corazones de ratones P1 - P3 o hasta 2 corazones de los ratones P4 - P6 a un r de 1,5 mltubo eaction que contiene 1 ml de mezcla de enzima y se corta el corazón en pequeños trozos con tijeras. Transferir la solución en 15 ml tubos de reacción.
      3. Incubar a 37 ° C durante 15 min. Para maximizar el contacto entre el tejido y las enzimas, poner el tubo 15 ml casi horizontalmente en la incubadora. Mezclar con la pipeta 5 - 10 veces arriba y abajo con una pipeta de 5 ml. Repita este paso tres veces.
      4. Añadir 7,5 ml de medio 2 (20% de FCS) para detener la reacción enzimática. Se filtra la suspensión celular a través de un filtro de células de 70 micras. Enjuague el filtro de células con 3 ml de medio 2.
      5. Centrifugar la suspensión celular a 300 xg durante 15 min y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 500 l de medio 1; lisis de glóbulos rojos no se requiere para otros experimentos. Pipetear 10 l de la suspensión de células en una cámara de recuento de células y determinar el número de células.
      6. Para una placa de 96 pocillos: semilla de 10.000 células por pocillo en 120 l de medio de 1 (2% de FCS). Lugarlas células en una incubadora (37 ° C y 5% de CO 2) y proceder inmediatamente a la transfección.
  2. La transfección de los cardiomiocitos neonatales con siRNAs o miRNAs
    1. Limpiar un banco con una solución descontaminante RNasa para eliminar las RNasas. Limpiar el siguiente material con una solución de descontaminación RNasa: 10-l, l-100, y 200-mu L pipetas y una caja de hielo. Descongelar alícuotas siRNA de acciones (100 m) en el hielo.
    2. Preparar 2 micras reservas de trabajo de Si / miRNAs en medio con suero reducido (98 l de medio con suero reducido + 2 l de 100 mM de stock siRNA). La madre de trabajo se debe utilizar el mismo día. No se recomienda la congelación.
    3. Añadir 4 l de la madre 2 M a 6 l de medio de suero reducido a un tubo de reacción de 0,5 ml (cantidad de un bien 96; SI concentración final / miARN en 140 l: ~ 57 nM). Elija un volumen apropiado para el número de pozos para ser transfectadas con un cierto si / miRNA.
    4. Preparar una mezcla maestra del reactivo de transfección. Utilice 10 l (0,6 l de reactivo de transfección + 9,4 l de medio de suero reducido) para cada pozo (96 pozos en total).
    5. Añadir la relación Si / miARN mezclar con la mezcla de reactivos de transfección. Incubar durante 5 minutos en hielo. Pipetear 20 l en cada pocillo. Se incuban las células durante 48 horas a 37 ° C y CO 2 al 5% y luego vuelva a colocar el medio de cada pocillo con 120 l de medio 1. Después de 24 horas o más, proceder a la fijación y tinción de inmunofluorescencia.
  3. La fijación y tinción de inmunofluorescencia
    1. Se elimina el medio y se lavan las células una vez con PBS. Cubrir las células con solución de formaldehído al 4% durante 20 min. Retire la solución de formaldehído y se lavan las células una vez con PBS, y luego cubrirlas con PBS para el almacenamiento o proceder a la inmunotinción.
    2. Incubar con el anticuerpo primario (concentración de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en 0,2% de Triton-X y suero de burro 5% durante al menos 2 h.Si la tinción de α-actinina (dilución 1: 400; monoclonal anti-α-actinina), mancha durante la noche a 4 ° C.
    3. Eliminar el anticuerpo primario y lavar 3 veces con PBS. Diluir el anticuerpo secundario en solución Hoechst 1: 400 y se incuba durante 1 h a TA protegidas de la luz. Eliminar el anticuerpo, lavar con PBS 3 veces, y cubrir las células con PBS para el almacenamiento a 4 ° C.
  4. La microscopía confocal de vídeo
    1. Utilizar un microscopio confocal para la adquisición de imágenes. Abra el software de imágenes. Abrir "Configuración A1plus" y active las casillas de c1, c2, y CH3. Establecer Ch1 a DAPI, CH2 para eGFP, CH3 para Cy3 y CH4 en CY4 haciendo clic en el menú desplegable.
      1. Para cada canal, haga clic en HV y ponerlo a 80 mediante el uso de la barra deslizante. Ajuste el offset a 0 mediante el uso de las barras de desplazamiento, y haga clic en el botón "Inicio" para establecer el agujero a la posición inicial. Ajuste el tamaño de escaneado a 1.024 x 1.024 haciendo clic en el menú desplegable.
      2. Haga clic en Optimizar para abrirventana "XYZ Tamaño de configuración". Casilla de verificación "Perfect Voxel" bajo "Paso sugerido (z)". Aumentar la intensidad de láser hasta que la imagen no es ni subexpuestas ni sobreexpuesta.
        NOTA: Por ejemplo; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, CH3 (Cy3): 100%, CH4 (Cy5): 1%. Establecer el desplazamiento de todos los canales a 0.
    2. Tomar fotos utilizando un objetivo 20X (200X). Escanear una imagen grande que consiste en imágenes de mosaico (por ejemplo, 3 x 3).
      1. En el software de imágenes, vaya a "Adquirir" y elegir la opción "Escanear imagen grande" en el menú desplegable. En "Área", seleccione "posición actual está en la esquina superior izquierda" en el menú desplegable y ajuste "Número de campos en las direcciones X e Y" a 3 x 3. Haga clic en "Scan".
  5. Análisis de imagen
    1. Definir el número de núcleos de cardiomiocitos contando señales H2B-Ch y el número de cardiomiocitos contando señales de α-actinina.
        <li> Haga clic en "Medida" y seleccione "Medición manual" en el menú desplegable. Seleccione la opción "Cuenta" en el siguiente menú desplegable. Haga clic en los núcleos con señales H2B-MCH, marcado y contarlas con ello. Haga lo mismo para las células α-actinina-positiva para obtener el número de cardiomiocitos.
    2. Contar S / G2 fase de cardiomiocitos con señales de eGFP-anillin nucleares (EGFP-anillin + / + H2BmCh núcleos). Haga clic en "Medida" y seleccione "Medición manual" en el menú desplegable. Seleccione la opción "Cuenta" en el siguiente menú desplegable. Marcar los núcleos con señales de eGFP-anillin y señales H2B-MCH haciendo clic sobre ellos.
    3. Contar los cardiomiocitos con señales de mitosis específica eGFP-anillin (por ejemplo, la Figura 1F y G), tales como señales citoplasmáticas, anillos contráctiles, y midbodies. Haga clic en "Medida" y seleccione "Medición manual" en el menú desplegable. Elija "cuenta" de la próxima Pulldown menú. Marcos cardiomiocitos con señales de mitosis específica eGFP-anillin (por ejemplo, la Figura 1F y G), las señales citoplasmáticas, anillos contráctiles, y midbodies haciendo clic sobre ellos.

2. Determinación de la nucleación en cardiomiocitos adultos por Langendorff disociación y espesor secciones de tejidos

  1. Aislamiento de cardiomiocitos adultos por Langendorff disociación
    1. Preparaciones antes de la disección del corazón
      1. Llenar una jeringa de insulina (aguja de calibre 30) con heparina (20 unidades / g de peso corporal). Agarre el ratón por la piel del cuello. Levantar y girar el ratón hacia atrás para dejar al descubierto el abdomen para inyección.
      2. Realizar una inyección intraperitoneal. Ponga el ratón heparinizada de nuevo en la jaula y esperar al menos 15 minutos antes de comenzar la disección del corazón. Enjuague y ventilar el aparato de Langendorff con 5 - 10 ml de tampón de perfusión (tampón de perfusión: NaCl mM 135, KCl 4 mM, MgCl 1 mM2, 2,5 mM HEPES, mM glucosa 5, y BDM 25 mM en ddH 2 O, se ajustan a pH 7,4 con NaOH).
    2. la disección del corazón
      1. Preparar una placa de Petri de 10 cm con frío (4 ° C) PBS y colocarlo en hielo. Llenar y ventilar una jeringa de 1 ml conectada a un (calibre 20) de la cánula con PBS. Fijar la cánula con plastilina en la frontera de la placa de Petri. Coloque la punta de la cánula ligeramente por debajo de la superficie de PBS.
      2. Sacrificar el ratón por dislocación cervical. Limpiar el abdomen con solución de etanol al 70%. Hacer una incisión desde el centro del abdomen para el esternón con tijeras quirúrgicas. Retire el diafragma y cortar el tórax bilateralmente con tijeras quirúrgicas.
      3. Levantar y fijar el esternón con una aguja de calibre 20, abrir la cavidad torácica, y agarre suavemente el corazón con unas pinzas anatómicas. Levantar el corazón y sacarlo de los pulmones y el sistema vascular mediante la reducción de los vasos del tracto de salida.
        NOTA: Para identificar la aorta, posicionar el corazón consu lado ventral hacia arriba. Esto disminuye la distancia entre ambas aurículas, por lo que la aorta con sus ramas se puede encontrar entre las aurículas. Dependiendo de la arquitectura corazón del individuo, las ramas se pueden quitar si la rama principal de la aorta es todavía lo suficientemente larga.
      4. Transferir el corazón a la placa de 10 cm de Petri que contiene PBS enfriado (véase la etapa 2.1.2.1). Canular el corazón tirando de la aorta ascendente en una cánula de inyección G20x1 ½, que fue mitigado por una multi-herramienta oscilante para evitar daños en los tejidos. Fijar la aorta con un hilo en la cánula. Enjuague suavemente el corazón con PBS para eliminar el exceso de sangre empujando el émbolo de la jeringa. Un ligero agrandamiento del corazón debe ser visible.
    3. la disociación del corazón Langendorff
      1. Conectar el corazón canulado rápidamente al adaptador de bloqueo Luer en el aparato de perfusión Langendorff. Perfundir el corazón con 30 ml de tampón de perfusión oxigenado a 37 ° C durante 5 min con un caudal de 1 gota / s. Thvelocidad de flujo e puede ser adaptado mediante la regulación del flujo de O 2 dentro del aparato de Langendorff utilizando la válvula reductora de presión (presión de entre 0 y 200 mbar).
      2. Preparar tampón de digestión inmediatamente antes de su uso: tampón de perfusión con 6 U de colagenasa B, 10.000 unidades de tripsina, y 50 mM de CaCl2. Retire el tampón de perfusión e iniciar la digestión enzimática mediante la adición de 30 ml de tibia (37 ° C) y oxigenada tampón de digestión.
        NOTA: La cantidad de colagenasa B necesita ser valorada en función de la actividad de diferentes lotes.
      3. Ajustar el flujo a una velocidad de 1 gota / s y digerir el corazón de 10 a 13 min. Para evitar la contaminación, no use el flujo de salida de nuevo. Transferir el corazón a una placa de 10 cm de Petri con 5 ml de tampón de digestión. Diseccionar el tejido manualmente con unas pinzas sujetando el corazón con un par de pinzas y con el otro par de rasgar el corazón en pedazos pequeños.
        NOTA: En este paso, las aurículas se puede separar, cortado en pequeñospiezas (con tijeras de iris), y se digirieron durante 30 minutos en 750 l de tampón de digestión en el incubador a 37 ° C con el fin de obtener células atriales aisladas. Para obtener los miocitos auriculares puros, pipetear hacia arriba y abajo varias veces con una pipeta de 1 ml. Detener la reacción enzimática mediante la adición de 750 l de solución de parada.
      4. Detener la digestión mediante la adición de 5 ml de solución de parada (tampón de perfusión con 5% de FBS y 50 mM CaCl 2). Con una pipeta serológica, filtrar la suspensión de células a través de un filtro de células 100-micras y recoger las células en un tubo de centrífuga de 50 mL. Centrifugar la suspensión celular se filtró a 80 xg durante 1 min a temperatura ambiente.
      5. Eliminar el sobrenadante y volver a suspender suavemente el sedimento celular en 10 ml de solución de parada con una pipeta serológica de 10 ml. Centrifugar la suspensión celular a 80 xg durante 1 min a temperatura ambiente.
      6. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de medio de cultivo (IMDM con 20% FCS, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales, 50 mg / ml cada uno de penicilina y estreptomicina, y 0,1 mM β-mercaptoetanol) para el cultivo. Como alternativa, continúe en el paso 2.2, "la tinción de inmunofluorescencia," y fijar las células.
      7. Para la fijación en placas de 24 pocillos, la placa 10000 de las células aisladas por pocillo en 8 g / ml cubreobjetos recubiertas con laminina en placas de 24 pocillos con 500 l de medio de cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 durante al menos 3 h .
  2. La tinción de inmunofluorescencia en cardiomiocitos aislados Langendorff en suspensión
    1. Fijar los cardiomiocitos aislados-Langendorff en 1 ml de PFA al 4% en PBS, pH 7,4, durante 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la suspensión de células a 800 xg durante 2 min a temperatura ambiente, eliminar el fijador, y lavar las células dos veces con PBS.
    2. Resuspender los cardiomiocitos fijos en 1 ml de PBS y, o bien proceder a la tinción de inmunofluorescencia o almacenarlos en 500 l de PBS por pocillo enuna placa de 24 pocillos a 4 ° C. Transferencia de una parte de la suspensión de células (~ 100-200 l) a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar la suspensión de células a 800 xg durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante.
    3. Permeabilizar, bloque, y teñir las células con el anticuerpo primario contra la α-actinina mediante la adición de 200 l de anticuerpo primario diluido 1: 400 en PBS con suero de burro 0,2% de Triton X-100 y 5% para 1 h a temperatura ambiente.
    4. Centrifugar a 800 xg durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Lavar el sedimento de células con PBS y centrifugar a 800 xg durante 2 min a temperatura ambiente. Descartar el sobrenadante y se incuban en 200 l de Alexa-Fluor-conjugado anticuerpo secundario (anti-ratón IgG1) diluido 1: 400 en colorante Hoechst (solución de trabajo: 1 mg / ml) durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
    5. Centrifugar a 800 xg durante 2 min a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante. Repita este paso. Evita que la muestra de la luz. Resuspend las células en 200 a 500 l de PBS y transferir 100-300 l de la suspensión celular a un pocillo de una cámara de microscopía. Cerrar la tapa de la cámara y almacenar las células a 4 ° C hasta que la imagen. Proteger de la luz.
  3. El análisis de la nuclearidad de cardiomiocitos aislados Langendorff
    1. Tomar imágenes de cardiomiocitos α-actinina manchados con un objetivo 25X, que corresponde a una ampliación 250X. Contar el número de núcleos H2B-MCH + cardiomiocitos sólo en aquellos que están manchadas regularmente por α-actinina y muestran la morfología típica en forma de barra y por lo tanto se supone que está intacta.
    2. Contar al menos 100 cardiomiocitos de tres corazones diferentes. Calcular los porcentajes de mononucleares, binuclear, y cardiomiocitos trinucleares.
      NOTA: Por lo general, las células binucleares debe recuperar alrededor del 80 - 90%, mientras que las células trinucleares y los que tienen un mayor número de núcleos son poco frecuentes (<1% en cardiomiocitos aislados Langendorff, <3% en rodajas gruesas). miocitos auriculares son significativamente más pequeños que los cardiomiocitos ventriculares. Típicamente, las células mononucleares constituyen el 90% de la población total.
  4. El aislamiento, la fijación, y la criopreservación de corazones adultos como preparación para rodajas gruesas
    1. Montar un aparato de perfusión para la fijación mediante la conexión de una jeringa de 50 ml a una llave de paso de 3 vías con un tubo de extensión Heidelberger y una segunda de 3 vías llave de paso. Fijar la jeringa en un soporte de tal manera que el flujo a través se habilita por la gravedad. Llenar el sistema con 15 ml de PBS.
    2. Siga los pasos 2.1.2.1-2.1.2.4, «preparado corazón." Conectar la cánula de inyección G20x1 ½ con el corazón para el adaptador de bloqueo Luer del aparato de perfusión lleno de-PBS libre de burbujas y perfundir con PBS. Llenar el sistema con 10 - 15 ml de formaldehído al 4% en PBS, que se perfunde entonces a través del corazón. Inmersión fijar el corazón en solución de formaldehído al 4% durante la noche.
    3. Reemplazar el formaldehído al 4%solución con PBS y lavar el corazón en PBS en un agitador horizontal a 150 rpm durante 8 h a temperatura ambiente. Intercambiar la PBS con una solución de sacarosa al 20% para deshidratar el corazón durante la noche a 4 ° C.
    4. Congelar el corazón en un medio de crio-incrustación en un pequeño molde.
      1. Configurar un vaso lleno de 2-metilbutano y colocarlo en una caja con hielo seco. Poner el corazón en un molde previamente congelación lleno hasta la mitad con la crio-medio de inclusión y se cubre completamente con la crio medio de inclusión. Con cuidado, colocar el molde en el vaso frío, evitando el contacto del medio de crio-incrustación con el 2-metilbutano. Almacenar el tejido congelado a -80 ° C hasta su uso.
  5. Preparación de cortes de corazón gruesas
    1. Utilice la siguiente configuración en un cryotome: una temperatura del objeto a -18 y -20 ° C, una temperatura de la cámara de -21 a la -23 ° C, un ángulo de compensación en el portacuchillas de 4 °, y las cuchillas de microtomo pluma R35.
    2. Extraer la junta criopreservadosrgan del recipiente de congelación y fijarlo en la platina con medio de crio-incrustación utilizando la plataforma de congelación rápida. Coloque el corazón de una manera tal que seccionamiento comienza en el vértice.
    3. Recorte rebanadas de 50 micras hasta que se logre un plano de corte uniforme y el órgano se hace visible. Cortar 50-mu M cortes de tejido utilizando el cryotome en modo manual con una velocidad lenta y con la placa estabilizadora colocado en el cuchillo. rebanadas de montaje sobre portaobjetos de microscopio tratados con solución salina. Deje que las rodajas se secan durante 30 minutos a temperatura ambiente y se almacenan las diapositivas a -80 ° C o la mancha directamente.
  6. La tinción de las rebanadas del corazón de espesor (núcleos y las membranas celulares)
    1. Tratar rebanadas del corazón con ARNasa A (20 mg / ml) en tampón de lavado (0,5 M NaCl, 0,1 M Tris pH 7,5, y EDTA 50 mM) en una cubeta de 1 h a 37 ° C. Incubar las rebanadas en 0,2% de Triton-X en tampón de lavado durante 30 min a temperatura ambiente. Lavar las rodajas dos veces durante 5 min cada uno en tampón de lavado en una cubeta en unaagitador horizontal a temperatura ambiente.
    2. Mancha durante la noche con 1 M A-PRO3 yoduro (642/661) y aglutinina de germen de trigo fluoresceína acoplada (WGA, 1: 100) en tampón de lavado a 4 ° C. Lavar las rodajas de tres veces durante 5 minutos cada uno con tampón de lavado en cubetas en un agitador horizontal y cubrirlas con medio de montaje alcohol de polivinilo con un reactivo de desvanecimiento anti y un cubreobjetos de vidrio.
  7. Adquisición de imágen
    1. Lo ideal es utilizar un microscopio láser confocal de barrido invertido equipado con una 40X / 1.15 NA objetivo de inmersión en agua. Búsqueda por ojo por un área dentro del sector que consiste en cardiomiocitos longitudinalmente alineadas; a tal fin, el canal de fluoresceína-WGA (Ex .: 488 nm) es el más adecuado.
      NOTA: Este paso es esencial, ya que los límites superior e inferior de los cardiomiocitos deben ser visibles dentro de la pila Z para los análisis posteriores. Como la profundidad de formación de imágenes está limitado a ~ 30 nm y el espesor de la rebanada es 50 m, no es posible imsecciones transversales de edad de estas células (longitud de la célula: ~ 120 micras).
    2. Ajustar la configuración en el software de imágenes. Abra el software de imágenes. Abrir A1plus Configuración y active las casillas de CH2, CH3 y CH4. Establecer CH2 para EGFP, CH3 para Alx546, y CH4 a Alx647 haciendo clic en el menú desplegable.
      1. Para cada canal, haga clic en HV y ponerlo a 80 mediante el uso de la barra deslizante. Ajuste el offset a 0 mediante el uso de las barras deslizantes. Haga clic en el botón "Inicio" para establecer el agujero a la posición inicial. Ajuste el tamaño de escaneado a 1.024 x 1.024 haciendo clic en el menú desplegable y haga clic en Optimizar para abrir la ventana "XYZ Tamaño de configuración". Marque la casilla "Perfect Voxel" bajo "Paso sugerido (z)".
    3. Haga clic en "Live Scan" y ajustar las intensidades de láser haciendo clic en las barras de desplazamiento en los canales individuales. Marque la casilla "Serie Z" en la ventana "ND Adquisición" y haga clic en el cuadro "definido por el botón superior". Definir la parte superior yBotón de la pila Z haciendo clic en los botones apropiados después de ajustar el enfoque en el microscopio. Establecer la anchura z paso a 0,5 micras.
      NOTA: La profundidad de la z-pila está limitada por la penetración óptica dentro del tejido y la relación señal-ruido.
    4. Ir a "Configuración" A1plus y establecer la línea media / Integral de 2-4 haciendo clic en el menú desplegable. Ajuste con precisión las intensidades de láser; el agujero debe ser tan pequeña como sea posible con el fin de imagen en un plano focal.
  8. Análisis de nucleación
    1. Abra el software de análisis de imágenes y cargar la pila Z de interés.
    2. determinar manualmente la nucleación en los z-pilas desplazándose a través de las diferentes capas de la pila con el fin de identificar las células que se encuentran completamente dentro de la pila; este es el caso cuando la tinción WGA es visible en todas las dimensiones. Contar el número de núcleos (la mayoría de ellos serán binuclear) y marcar la célula analizada por una anotación en el software.
      3. <li> Determinar el número de núcleos CM (H2B-MCH +) y los núcleos totales (A-PRO3 +) en reconstrucciones 3D para los canales individuales (Figura 2D). En el software de imagen, haga clic en "binario" y elegir la opción "Definir 3D Umbral" en el menú desplegable. Elija del menú del canal pulldown sea Alx546 para el número de núcleos cm o Alx647 para el número de núcleos totales. Al hacer clic en las flechas correspondientes, configurar el programa para "4x Smooth", 1x Limpio, y llenar los agujeros en ON. Marque la casilla "Tamaño" y ponerlo a 5 micras utilizando la barra deslizante. Establecer el umbral utilizando la barra de desplazamiento hasta que aparezcan objetos separados.
      NOTA: Después de aplicar la fragmentación, la ventana de resultados muestra una tabla de eventos cuantificados y una fragmentación de color de la imagen. Como algunos núcleos contacto directo entre sí, corregir manualmente el resultado automático de medición de dobletes, que no pueden estar separados correctamente por el software.

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Representative Results

Con el fin de analizar los efectos de siRNAs / miRNAs en la actividad del ciclo celular de cardiomiocitos postnatales in vitro, los cardiomiocitos de ratones MYH6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin doble transgénicos fueron aislados en el día postnatal 3 (P3) y se transfectaron con actividad inductora de ciclo celular miR199 5, p27 siRNA, y siRNA Fzr1. En comparación con el control negativo (Figura 1A), las imágenes de miR199- (Figura 1B) y siRNA p27- (Figura 1C) transfectadas cardiomiocitos muestran una inducción de la actividad del ciclo celular. En el modelo de ratón eGFP-anillin, siRNAs contra Fzr1 se pueden usar como controles de transfección, como la inhibición de la Fzr1 conduce a la acumulación de proteína de fusión eGFP-anillin en los núcleos de las células transfectadas y una pérdida de Fzr1 conduce a la inhibición de la APC Fzr1. Fzr1 es un cofactor de la ligasa E3 complejo promotor de la anafase, que se dirige anillin de proteasla degradación omal. La figura 1D muestra una imagen confocal visión general de los cardiomiocitos transfectadas con siRNA Fzr1 3 días después de la transfección, lo que indica una eficacia de transfección de ~ 45%. Cardiomiocitos que realizan endorreduplicación (por ejemplo, después de la caída de p27 6) muestran la expresión de eGFP-anillin exclusivamente nuclear (Figura 1E) o son eGFP-anillin negativo (véase el debate). No expresan eGFP-anillin en M-fase-típico localizaciones (Figura 1F y G), como endorreduplicación sólo se compone de una fase de endo-S (eGFP-anillin-positiva) y una fase de endo-G (eGFP-anillin-negativo ). En la fase de endo-G, la APC está activo, lo que resulta en la ubiquitinación y degradación de eGFP-anillin en el proteasoma.

La cuantificación de las porciones de cardiomiocitos mono- y binucleadas en la etapa de adulto se puede realizar ya sea a nivel de una sola célula después de la Langendorff disociación de MYH6-H2B-MCH corazones transgénicos o en gruesos cryoslices de corazones transgénicos. Después de la digestión enzimática del tejido del corazón en el aparato Langendorff, aurículas y los ventrículos se pueden separar mecánicamente y se analizaron de forma independiente el uno del otro. La figura 2A muestra una imagen representativa de los cardiomiocitos ventriculares transgénico H2B-MCH no fijos después del aislamiento de Langendorff con un alto grado de cardiomiocitos binucleadas, según lo indicado por la expresión H2B-MCH nuclear. Por el contrario, la mayoría de los miocitos auriculares se mononucleadas (Figura 2B). A medida que la digestión enzimática no resulta en células individuales 100%, el patrón de cross-estriación revelado por tinción con α-actinina facilita la discriminación entre los cardiomiocitos binucleadas (patrón continuo de cross-estriación, Figura 2C) y dobletes de células. La figura 2D muestra un ejemplo de la identificación de un cardiomiocito binucleada en por lorebanada cateto.

reconstrucciones en 3D de rodajas gruesas de corazones transgénicos adultos MYH6-H2B-MCH pueden ser utilizados para determinar la proporción de núcleos de cardiomiocitos en condiciones fisiológicas en el tejido. Con el módulo de 3D de software de formación de imágenes, los núcleos Hoechst-manchada y núcleos H2B-MCH-positivas pueden ser detectados y contados de forma automática, como se ilustra en la Figura 2E. El resultado final debe ser corregido manualmente para dobletes, es decir, núcleos que tocan directamente entre sí, en este caso. Para analizar el índice de nucleación de los cardiomiocitos en rodajas gruesas, es necesario desplazarse manualmente a través de la pila, ya que los núcleos No mientas necesarias dentro de un plano z. WGA tinción permite la detección de bordes de la celda.

Figura 1
Figura 1: Ejemplos de EnVitro Visualización de actividad del ciclo celular en cardiomiocitos postnatales después de la transfección con ARNip. (AD) cardiomiocitos P3 / corazones de MYH6-H2B-MCH-eGFP anillin teñidas para la α-actinina (blanco). núcleos de cardiomiocitos se identifican por la señal H2B-MCH (rojo), la actividad del ciclo celular mediante señales eGFP-anillin (verde), y los núcleos de tinte nuclear Hoechst (azul). Cardiomiocitos (A) P3 transfectadas con siRNA scramble sirven como control negativo. La barra es de 100 micras. Cardiomiocitos (B) P3 transfectadas con pantalla de miRNA-199 significativamente más señales de eGFP-anillin que el control (A). La barra es de 100 micras. (C) Ejemplo de señales de eGFP-anillin exclusivamente nucleares después de la transfección con ARNip de p27, lo que indica endorreduplicación. La barra es de 80 micras. (D) la transfección con siRNA contra Fzr1 para la determinación de la eficiencia de transfección. Como ac-eGFP anillinacumula, el número de eGFP-anillin + cardiomiocitos indica la eficiencia de transfección. La barra es de 80 micras. (EG) Diferentes localizaciones de EGFP-anillin (verde) en los cardiomiocitos durante el ciclo celular: localización nuclear (flecha en E), anillo contráctil (flechas en F), y la localización de la mitad del cuerpo (flecha en G). La barra es de 20 micras de (E) y 10 micras de (F y G). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Ejemplos para la Evaluación de multinucleación por el aislamiento de Langendorff de los cardiomiocitos de ratones H2B-MCH y por el análisis 3D de rodajas gruesas. (A, B) ventricular (A) y la fibrilación (B) de los cardiomiocitos adultos corazones de H2B-MCH ratones transgénicos tras el aislamiento mediante la disociación de Langendorff. Las barras son de 50 micras. (C) Los cardiomiocitos de los corazones MYH6-H2B-MCH teñidas para la α-actinina (verde). núcleos de cardiomiocitos se identifican por la señal de H2B-MCH (rojo). La barra es de 10 micras. Cardiomiocitos (D) binucleadas en una rebanada gruesa (flechas). núcleos de cardiomiocitos se identifican por la señal H2B-MCH (rojo), los bordes de celda mediante tinción con WGA (verde), y los núcleos de ToPro3 (blanco). La barra es de 50 micras. (E) de flujo de trabajo para el análisis 3D de binucleación en rodajas gruesas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Existe una controversia sobre si los cardiomiocitos son capaces de volver a entrar en el ciclo celular y dividir después de la lesión y durante la homeostasis del tejido. Los valores para el volumen de negocio básico de cardiomiocitos se han dado en el rango entre 1% 1 y 80% 7. También después de una lesión cardíaca, la inducción de la actividad del ciclo celular y la generación de nuevos cardiomiocitos se ha informado en la zona fronteriza, con valores entre 0,0083% 8 y 25 - 40% 7. Estas discrepancias pueden explicarse en parte por diferentes enfoques experimentales para identificar núcleos cardíacos, un proceso que es muy difícil en secciones histológicas 9 y durante la división celular. Como cardiomiocitos son propensos a las variaciones del ciclo celular, es de crucial importancia para distinguir la división celular auténtica de endorreduplicación y mitosis acytokinetic, que conducen a células poliploides y multinucleadas. porla identificación de la división celular, es necesario para visualizar características de la división celular, tales como anillos contráctiles y midbodies, así como para determinar el porcentaje de los cardiomiocitos binucleadas. Hemos desarrollado técnicas para analizar la actividad del ciclo celular en cardiomiocitos en detalle y para determinar su grado de nuclearidad en células aisladas o en secciones gruesas.

Es importante tener en cuenta que el sistema de eGFP-anillin proporciona una prueba directa de la división celular, a través de la visualización de un anillo contráctil simétrica (Figura 1F) y el cuerpo central (Figura 1G), y la prueba indirecta para la endorreduplicación y la mitosis acytokinetic. Como se ha descrito anteriormente, la aparición de una ingresión unilateral del anillo contráctil es un indicador de binucleación 10, y esto se puede observar con el sistema de eGFP-anillin.

Endorreduplicación se sugiere siempre que no anillo contráctil o IMdbody se observó, lo que hace que los cálculos de las probabilidades de detección de estas localizaciones obligatoria. Suponiendo una duración del ciclo celular de 25 h, una duración media de visibilidad anillo contráctil de 20 min, y una persistencia midbody de 1 h, no debe haber 1 anillo contráctil en 100 células en división eGFP-anillin-positivos y 4 midbodies. Estadísticamente hablando, tendría que ser analizado para distinguir la división celular de las variaciones del ciclo celular con un mínimo de células eGFP-25 anillin-positivos. Este número cambia en consecuencia como la duración del ciclo celular (que es a menudo desconocida) aumenta o disminuye. Esto también implica que la mayoría de las señales de eGFP-anillin será nuclear (Figura 1E), como M-fase, la única fase con localizaciones no nucleares, sólo dura aproximadamente 1 h.

Durante el desarrollo postnatal, binucleación tiene lugar en los corazones de ratón y se incrementa a 90% en cardiomiocitos ventriculares (~ 25% en los seres humanos) 11. for el análisis de la regeneración en el corazón, es importante para determinar el grado de binucleación. Se describen dos métodos para abordar esta característica morfológica importante: es decir, la disociación de Langendorff y la creación de secciones gruesas de tejido cardiaco. Mientras que el aislamiento Langendorff es más fácil y más rápido, la morfología de las secciones gruesas es que consume más tiempo, sino también más precisa. Curiosamente, se ha encontrado que el aislamiento Langendorff sobreestima el porcentaje de cardiomiocitos binucleares. Esto podría ser debido a las diferentes tasas de supervivencia de las células mononucleares y binucleares durante este procedimiento más bien rígido.

A medida que la inducción de la proliferación de los cardiomiocitos postnatales es un enfoque emergente en la regeneración cardiaca, este protocolo se describe un sistema de detección mediante la combinación de dos líneas de ratones transgénicos, MYH6-H2BmCh y CAG-eGFP-anillin. Cardiomiocitos aislados de corazones en los días postnatales P1 - P6 puede ser fácilmente cultivadas y transfectadas con miRNAs osiRNAs o tratados con bibliotecas de moléculas pequeñas. núcleos de cardiomiocitos se pueden detectar de forma manual o automáticamente por algoritmos de software, y potenciales "éxitos" se pueden determinar por un aumento en el número MCH + núcleos. Discriminación de la división celular de endorreduplicación y mitosis acytokinetic se puede hacer mediante la cuantificación de las diferentes localizaciones de las señales de eGFP-anillin. Este sistema debe arrojar nueva luz sobre los mecanismos de regulación de la proliferación de los cardiomiocitos postnatales subyacente y puede conducir al descubrimiento de nuevos agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades cardíacas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm Petri dish Sarstedt 821472
100 µm cell strainer Becton Dickinson GmbH/Falcon 352360
2,3-Butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich B0753
G20x1 ½ injection cannula, Sterican Braun, Melsungen 4657519
20 gauge needle Becton Dickinson GmbH 301300
24-well plates Becton Dickinson GmbH/Falcon 353047
2-Methyl-butane Carl Roth GmbH + Co. KG 3927.1
37% formaldehyde solution AppliChem GmbH  A0936,1000
3-way stopcock B. Braun Medical Inc. 16494C
50 mL syringe B. Braun Medical Inc. 8728810F
70% ethanol Otto Fischar GmbH 27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody Jackson ImmunoResearch 115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG Sigma-Aldrich, Steinheim A7811
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area Greiner bio-one 675986
Collagenase B Roche 11088815001
confocal microscope Eclipse Ti-E Nikon
cryostat CM 3050S Leica
donkey serum Jackson Immuno Research, Suffolk, GB 017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
EDTA Sigma-Aldrich E4884
fetal calf serum PromoCell, Heidelberg
Formaldehyde solution (4%) PanReac AppliChem A3697
Gelatine from porcine skin, Type A Sigma-Aldrich, Steinheim G2500
glass coverslips VWR 631-0146
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Heidelberger extension tube IMPROMEDIFORM GmbH MF 1833
Heparin-Natrium Ratiopharm 5394.02.00
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HistoBond microscope slides Marienfeld 0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL) Sigma Aldrich, Taufkirchen B2261
Insulin syringe Becton Dickinson GmbH 300334
Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) Gibco/Life Technologies, Darmstadt 21980-032
KCl Sigma-Aldrich P9333
Laminin Corning 354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti Nikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt 13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey) Jackson ImmunoResearch 715-175-151
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
microcentrifuge tube Sarstedt 72690
Mini shaker VWR 12620-940
mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p Ambion/Thermo Fischer Scientific 4464066
Biopsy Mold Sakura Finetek/ VWR 4565
M-slide 8-well ibiTreat ibidi 80826
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NaOH Merck Millipore 567530
negative control(scrambled RNA) Ambion/Thermo Fischer Scientific AM4611
Neonatal Heart Dissociation Kit Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach 130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit Nikoninstruments, Düsseldorf
Non essential amino acids, NEAA Gibco/Life Technologies, Darmstad 11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum Medium Gibco 51985-026
P21-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
P27-siRNA Ambion/Thermo Fischer Scientific 4390771
Penicillin/Streptomycin Gibco/Life Technologies, Darmstadt 15140-122
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Steinheim 14190-094
Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading Sigma-Aldrich 10981
RNase A Qiagen 1007885
RNaseZap Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt AM9780
sample containers Vitlab 80731
Serological pipette Greiner 607180
software NIS Elements Nikon
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura Finetek/ VWR 25608-930
ToPro3 iodide (642/661) Molecular probes/ThermoFisher Scientific T3605
Tris Sigma-Aldrich T1503
Triton X Fluka 93418
Triton X-100 Fluka 93418
Trypsin Sigma-Aldrich T1426
Wheat germ agglutinin (WGA) Fluorescein labeled Vector Laboratories VEC-FL-1021-5
α-actinin antibody Sigma-Aldrich A7811
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich, Steinheim M3148

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References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
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  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

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Biología del Desarrollo No. 120 biología de miocardio los cardiomiocitos proliferación los ratones genéticamente alterados el desarrollo cardíaco biología celular cultivo celular
La visualización de las variaciones del ciclo celular y la determinación de la nucleación en cardiomiocitos postnatales
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Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D.,… More

Raulf, A., Voeltz, N., Korzus, D., Fleischmann, B. K., Hesse, M. Visualization of Cell Cycle Variations and Determination of Nucleation in Postnatal Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (120), e55204, doi:10.3791/55204 (2017).

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