Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Summary

Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l'ingénierie des constructions oesophagiennes pour l'implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l'objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l' œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l'oesophage menant à l'incapacité de manger ^1. L'incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l'identification de l'entité de la maladie en 1993. L'incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000 ^2. Une nouvelle approche chirurgicale attrayant pour le traitement à long gap atrésie de l'œsophage consiste à générer des constructions de tissu pour l'implantation en utilisant les propres cellules du patient. Ces cellules en association avec des échafaudages synthétiques vont générer une construction autologues qui ne nécessite pas la suppression immunitaire. Certains groupes ont déjà commencé à enquêter sur les États-Unise des cellules souches ressemblant à oesophagien ingénierie tissulaire ^3, ainsi que l'utilisation de cellules épithéliales de l' œsophage natifs pour repeupler la muqueuse ^4-7. Les maladies qui sont présents dans l'oesophage des patients pédiatriques sont souvent difficiles à diagnostiquer ou étudier sans intervention. En outre, les modèles animaux utilisant ou in vitro immortalisés modèles de lignées cellulaires pour les maladies pédiatriques comme EoE n'englobent la pathogenèse de la maladie exacte ou des différences spécifiques aux patients ^8. Par conséquent, la possibilité d'étudier le processus de la maladie d'un patient in vitro afin d'identifier des antigènes de la maladie de déclenchement spécifiques, évaluer les mécanismes sous – jacents et d' enquêter sur les traitements médicamenteux serait nouveau et fournir aux cliniciens des informations qui peuvent aider dans le traitement des patients.

Il y a eu de nombreux types de cellules autologues ou spécifiques à un patient qui ont été proposés pour une utilisation en tissuingénierie e et étudier la pathogenèse de la maladie humaine. Toutefois, certains de ces types de cellules sont limitées dans leur capacité à générer suffisamment de cellules d'un phénotype spécifique pour ensemencer un grand échafaudage ou d' effectuer un débit élevé des études in vitro. L'utilisation de cellules souches pluripotentes ou multipotentes a été le sujet de discussion de recherche beaucoup, cependant, les limites et les lacunes pour l' utilisation de ces cellules ont été bien décrits ^9. L'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines est fortement débattue et présente de nombreuses questions éthiques. Plus important encore , ces cellules forment des tératomes, qui sont semblables à une tumeur, si elles ne sont pas différenciés de leur état pluripotentes avant de les livrer dans un hôte vivant ^10. En outre, l'utilisation de cellules souches embryonnaires ne serait pas le patient spécifique et peut déclencher une réponse allogénique et la nécessité d' une suppression immunitaire ^10. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes qui peuventdériver à partir des cellules d'un patient. des cellules somatiques telles que les cellules de la peau, peuvent être amenés à un état pluripotent en utilisant une variété de techniques d'intégration et de non-intégratifs. Ces cellules servent alors comme une source de cellules spécifiques au patient pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie. L'intégration du matériel génétique indésirable dans ces cellules est une préoccupation beaucoup ont décrit et même si les séquences sont complètement CSPi enlevés semblent conserver une "mémoire" épigénétique vers le type de cellule à partir de laquelle ils sont dérivés ^11. Ces cellules vont également former des tératomes in vivo si non différenciée avant la transplantation ^11. De nombreux protocoles de différenciation ont été étudiés en se concentrant sur les lignées épithéliales ^{12, 13, 14,} cependant, il est très important de noter que les types cellulaires résultantes à la fin de la différenciation ne sont pas homogènes et oeul possèdent une fraction du type cellulaire d'intérêt. Cela se traduit par un faible rendement et la nécessité de purifier le type cellulaire souhaité. Bien que CSPi sont une source potentielle de cellules spécifiques au patient, le processus pour obtenir un type d'intérêt soit pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie cellulaire est très inefficace.

Des cellules épithéliales humaines ont été isolées avec succès à partir d' une variété de deux tissus malades et non malades dans le corps humain , y compris: ¹⁵ poumon, du sein ^16, l' intestin grêle ^{17, 18} côlon, de la vessie et de l' œsophage ^{19 20.} Il est important de noter que les cellules humaines primaires ont un nombre fini de passages dans lesquels le phénotype est maintenu ^{21, 22.} Malheureusement, cela signifie que le nombre de cellules nécessaires pour la recherche de la maladie ou pour l'ensemencement d'un échafaudage d'ingénieriepour l'implantation ne peut pas être atteint. Par conséquent, de nouvelles techniques sont nécessaires pour étendre les cellules du patient, tout en conservant un phénotype épithélial. Reprogrammation conditionnelle des cellules épithéliales normales et cancéreuses en utilisant des cellules nourricières et inhibiteur de ROCK a été décrite en 2012 par Liu et al. ^{2 3.} Cette technique a été utilisée pour développer des cellules épithéliales cancéreuses obtenues à partir de biopsies de la prostate et le cancer du sein en utilisant des cellules nourricières irradiées, inhibiteurs de ROCK et moyennes de reprogrammation conditionnelle. L'objectif était de générer suffisamment de cellules pour des tests in vitro tels que le dépistage des drogues. Cette technique est capable de se dilater par les cellules épithéliales indéfiniment "reprogrammation" de ces cellules à une tige ou à l'état géniteur analogue, ce qui est très proliférative. Il a été démontré que ces cellules sont non tumorigènes et ne possèdent pas la capacité de former des tératomes ^{23, 24.} En outre, aucundes anomalies chromosomiques ou les manipulations génétiques étaient présents après repiquage ces cellules en culture en utilisant cette technique ^{23, 24.} Plus important encore, ces cellules ne sont capables de se différencier dans le type cellulaire natif d'intérêt. Par conséquent, cette technique offre un grand réservoir de cellules épithéliales spécifiques au patient pour enquête sur la maladie ou l'ingénierie tissulaire, sans la nécessité d'immortalisation.

L'obtention d'un tissu épithélial d'un organe spécifique afin d'étudier les processus de la maladie est souvent limitée et pas toujours possible en raison du risque patient. Pour les patients souffrant d'une maladie de l'oesophage ou de défauts, la récupération de biopsie endoscopique est une approche mini-invasive pour l'obtention d'un tissu épithélial qui peut être dissocié et conditionnellement reprogrammé pour fournir une source de cellules indéfinie qui est spécifique à la muqueuse de l'oesophage du patient. Ceci permet alors d'études in vitrodes cellules épithéliales pour évaluer les processus de la maladie et l'écran pour thérapeutiques potentiels. Un processus de la maladie qui pourrait grandement bénéficier de cette approche est éosinophile oesophagite, qui a été décrit comme une maladie allergique de l'œsophage ^8. Des tests d'allergie ainsi que des approches thérapeutiques pourraient être évalués in vitro en utilisant les propres cellules épithéliales du patient et ces données peuvent ensuite être transférés sur le médecin traitant pour élaborer des plans de traitement individualisés. La technique de reprogrammation conditionnelle en combinaison avec l'obtention de biopsies endoscopiques chez des patients pédiatriques offre la possibilité d'étendre les cellules épithéliales normales de l'œsophage chez un malade indéfiniment. Cette source de la cellule pourrait donc être associé avec des échafaudages naturels ou synthétiques pour fournir une option chirurgicale spécifique au patient pour des défauts, d'une maladie ou d'un traumatisme. Avoir un nombre de cellules indéfinie permettrait ingénieur des constructions oesophagiennes qui possèdent un tout réensemencéeslumen avec les cellules épithéliales de l'œsophage, afin de contribuer à faciliter la régénération des types de cellules restantes.

Protocol

biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d'examen institutionnel (IRB # 13-094). 1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination. Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d'eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Aut…

Representative Results

Un résumé des principales étapes de l' isolement des cellules épithéliales de l' œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B).</stro…

Discussion

Les étapes les plus importantes dans le but d'isoler et d'étendre les cellules épithéliales de l'œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d'atteindre…

Materials

Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15ml Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50ml Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658