Doku Mühendisliği ve Hastalık Soruşturma Kullanılmak Üzere Pediatrik İnsan Özofagus Epitel Hücreleri koşullu yeniden programlanması
Summary
koşullu yeniden programlamayı kullanarak insan pediatrik özofagus epitel hücrelerinin genişlemesi kusurları veya yaralanma tedavi ve tedavi amaçlı testler için bir rezervuar olarak hizmet otolog implantasyon için özofagus yapıları mühendislik için kullanılabilir hücrelerin hastaya özgü nüfusa sahip araştırmacılar sağlar.
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
Özofagus doku mühendisliği ve eozinofilik özofajit (EÖ) son on yılda pek çok laboratuvarda araştırma odağı olmuştur. Böyle özofagus atrezisi gibi konjenital defektler, 1 yemek yetersizlik önde gelen yemek borusu eksik gelişmesi ile sonuçlanır yaklaşık 1 4,000 canlı doğumda, görülür. EÖ insidans ve prevalansının 1993 yılında hastalık varlığın kimlik EÖ insidansı 10 kişi-yıl başına / 100,000 0.7 arasında değiştiği ve yaygınlık 43 / 100,000 2 0.2 arasında değişmektedir beri artış olmuştur. çok uzun aralıklı özefagus atrezisi tedavisi için yeni bir çekici cerrahi yaklaşım hastanın kendi hücrelerini kullanarak implantasyon için doku yapıları üreten oluşur. Sentetik iskele ile bağlantılı olarak bu hücreler bağışıklık bastırma gerektirmeyen bir otolog yapı oluşturur. Bazı gruplar zaten bizi araştırmaya başlamışlardır7 – özofagus doku mühendisliği 3 yanı sıra yerli özofagus epitel hücrelerinin kullanımı için kök benzeri hücreler e mukozasında 4 yeniden doldurmak için. pediatrik hastaların yemek borusunda mevcut hastalıklar sıklıkla teşhis ya da müdahale olmadan çalışmaya zordur. Ayrıca, kullanan hayvan modelleri ya da in vitro tam hastalık patogenezi veya hasta belirli farklılıklar 8 kapsayacak yok EÖ gibi pediatrik hastalıklar için hücre hattı modelleri ölümsüzleştirdi. Bu nedenle, sırayla in vitro bir hastanın hastalık sürecini incelemek için yetenek, spesifik hastalık tetikleme antijenleri tespit yatan mekanizmaları değerlendirmek ve roman ve hasta tedavisinde yardımcı olabilecek bilgiler klinisyenlere sağlayacak ilaç tedavileri araştırmak için.
Tissu'nun kullanılmak için önerilmiştir, birçok otolog veya hasta açısından spesifik hücre tipleri olmuşture mühendisliği ve insan hastalık patogenezini okuyan. Bununla birlikte, bu hücre tiplerinin, bazı büyük iskele tohum ya da in vitro çalışmalarda yüksek verim gerçekleştirmek için belirli bir fenotip yeterli hücre oluşturmak için kendi yeteneği sınırlıdır. Pluripotent veya multipotent kök hücrelerin kullanımı çok araştırma tartışma konusu olmuştur, ancak bu hücrelerin kullanımı için sınırlamalar ve eksiklikleri de 9 tarif edilmiştir. İnsan embriyonik kök hücrelerin kullanımı çok tartışılan ve birçok etik sorunlar karşımıza çıkar. En önemlisi, bu hücrelerin kendi pluripotent devletten önce yaşayan bir ev sahibi 10 içine sunmaya ayırt değilse, bir tümöre benzer teratom oluştururlar. Ayrıca, embriyonik kök hücrelerin kullanımı hastaya özgü olmaz ve bir allojenik tepki ve bağışıklık baskılanması 10 ihtiyacını ortaya olabilir. Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) o can pluripotent hücrelerdirhastanın kendi hücreleri elde edilebilir. örneğin deri hücreleri gibi somatik hücreler, birleştirici ve bütünleştirici olmayan çeşitli teknikler kullanılarak pluripotent duruma indüklenebilir. Bu hücreler daha sonra, doku mühendisliği ya da hastalık inceleme için hastaya özel hücre kaynakları olarak görev yapar. Bu hücrelerin içine istenmeyen genetik materyalin entegrasyonu birçok tarif var ve diziler bile tamamen kaldırıldı iPSCs onlar 11 türetildikleri hücre tipine karşı bir epigenetik "hafıza" korumak için görünen bir husustur. Transplantasyon 11 öncesinde farklılaşmış takdirde Bu hücreler, aynı zamanda in vivo olarak teratomlar oluşturacaktır. Bir çok farklılaşma protokolleri ancak, farklılaşma sonunda elde edilen hücre tipi homojen ve O değildir dikkat etmek önemlidir, epitel soy, 12, 13, 14 odaklanan incelenmiştirnly ilgi hücre tipinin bir bölümünü sahiptirler. Bu düşük verim ve istenen hücre türü arındırmak için ihtiyacı ile sonuçlanır. iPSCs potansiyel hastaya özgü hücre kaynağı olsa da, proses doku mühendisliği veya hastalık araştırma biri için ilgi konusu bir hücre tipi çok yetersiz elde edildi.
Akciğer 15, meme 16, ince bağırsak, 17 kolon 18, mesane 19 ve yemek borusu 20: insan epitelyum hücrelerinin başarılı dahil olmak üzere insan vücudunda hastalıklı olmayan hastalıklı doku hem de çeşitli izole edilmiştir. İnsan birincil hücreler fenotipik 21, 22 muhafaza edildiği geçitlerin sonlu sayıda olduğunu not etmek önemlidir. Ne yazık ki, bu demektir ki bir hastalık inceleme ya da bir mühendislik iskele tohumlama için gereken hücre sayısıimplantasyon için elde edilemez. Bu nedenle, yeni teknikler de epitel fenotipi muhafaza ederken, hastanın hücreleri genişletmek için ihtiyaç vardır. Besleyici hücreler ve kaya inhibitörü yararlanarak normal ve kanserli epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlama Liu ve arkadaşları tarafından, 2012 de tarif edilmiştir. 2 3. Bu teknik, ışınlanmış besleyici hücreler, ROCK önleyicisi ve koşullu yeniden programlama ortamı kullanılarak prostat ve meme kanseri biyopsilerinden elde edilen kanser epitelyal hücreleri genişletmek için kullanılmıştır. Hedefi, ilaç taraması gibi, in vitro tahliller için yeterli hücre elde etmek olmuştur. Bu teknik, yüksek proliferatif bir kök veya projenitör gibi devlet için "yeniden programlama", bu hücreler tarafından süresiz epitel hücreleri kadar esneme kabiliyetine sahiptir. Hücreler olmayan tümörijenik ve teratom 23, 24 oluşturmak için yeteneğine sahip olmadıklarını ortaya konmuştur. Bundan başka, herhangi birkromozomal anomali veya genetik manipülasyonlar bu tekniği 23, 24 kullanılarak kültürde bu hücrelerin Pasajlanması sonra hazır bulundu. En önemlisi, bu hücreler sadece ilgi yerli hücre tipine içine ayırt edebiliyoruz. Bu nedenle, bu teknik ölümsüzleşme gerek kalmadan hastalığı soruşturma ve doku mühendisliği için hastaya özgü epitel hücrelerinin büyük bir hazne bulunmaktadır.
hastalık süreçlerini araştırmak için özel bir organdan epitel dokusu elde nedeniyle hasta riskten kaynaklanabilecek olası genellikle sınırlı değil her zaman. özofagus hastalığı veya kusurları muzdarip hastalar için, endoskopik biyopsi alma ayrışmış ve şartlı o hastanın yemek borusu mukozasında özgü belirsiz bir hücre kaynağı sağlamak için yeniden olabilir epitel doku elde etmek için minimal invaziv bir yaklaşımdır. Bu, daha sonra, in vitro çalışmalar için izin verirepitel hücrelerinin potansiyel tedavi için hastalık süreçlerini ve ekrana değerlendirmek. Büyük ölçüde bu yaklaşımdan fayda olabilir Bir hastalık süreci yemek borusu 8 alerjik hastalık olarak tarif edilmiştir Eozinofilik Özofajit vardır. Alerji testleri yanı sıra tedavi yaklaşımları hastanın kendi epitel hücreleri kullanılarak in vitro değerlendirilebilir ve bu veriler daha sonra bireyselleştirilmiş tedavi planı geliştirmek için tedavi eden hekimin üzerine geçirilebilir. pediatrik hastalarda gelen endoskopik biyopsilerin ile birlikte koşullu yeniden programlama tekniği herhangi hastadan süresiz normal yemek borusu epitel hücreleri genişletmek için yeteneği sunar. Bu hücre kaynağı, bu nedenle kusur, hastalık ya da travma nedeniyle bir hastaya özgü cerrahi seçenek sunmakta doğal veya sentetik iskele ile birlikte takım olabilir. belirsiz hücre sayısına sahip olan tamamen reseeded sahip özofagus yapıları mühendisi yardımcı olacaksırayla özofagus epitel hücreleri ile lümen kalan hücre tipleri yenilenmesini kolaylaştırmak için.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hasta biyopsilerinden özofagus epitel hücreleri izole ve genişletmek için en önemli adımlar şunlardır: 1) yeterli minimal hücre ölümü ile biyopsi doku dissociating; 2) temin ROCK önleyicisi, her bir değiştirilen ortam hücre kültürü ortamına ilave edilir; 3) önerilenden daha fazla besleyici hücreler kullanmayın; 4) Temiz aseptik kültürünü korumak; ve 5) izdiham ulaşmadan hemen önce geçiş hücreleri.
Nedeniyle şartlı yeniden programlama için elde edilen biyops…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the ‘hybrid construct’ approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. . Molecular Cell Biology. , (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
