Betinget Omprogrammering av Pediatric Menneskelig Esophageal Epitelceller for bruk i Tissue Engineering og sykdom Investigation

Summary

Utvidelse av menneskelige pediatriske esophageal epitelceller benytter betinget omprogrammering gir etterforskere med en pasientspesifikk populasjon av celler som kan benyttes for prosjektering esophageal konstruksjoner for autolog implantasjon å behandle defekter eller skade og fungere som et reservoar for terapeutiske utvelgelsesassays.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

Esophageal tissue engineering og eosinofil øsofagitt (EoE) har vært fokus for forskning på mange laboratorier i løpet av det siste tiåret. Medfødte defekter, slik som esophageal atresi, er sett i omtrent 1 i 4000 levende fødte, noe som resulterer i mangelfull utvikling av spiserøret som fører til manglende evne til å spise ^en. Forekomsten og utbredelsen av EoE har vært på vei oppover helt siden identifikasjon av sykdom enhet i 1993. Forekomsten av EoE varierte 0,7 til 10/100 000 per person-år, og forekomsten varierte 0,2 til 43/100 000 ^2. En ny kirurgisk attraktiv metode for å behandle langt hull esophageal atresien består i å generere vev konstrukter for implantering utnytte pasientens egne celler. Disse cellene i forbindelse med syntetiske stillas vil generere et autologt konstruksjon som ikke krever immunundertrykkelse. Noen grupper har allerede begynt å undersøke osse stilk-lignende celler for øsofageal vevsteknologi ^3, så vel som anvendelse av naturlige esophageal epitelceller for å re-populere mucosa ^{4 – 7.} Sykdommer som er til stede i spiserøret av pediatriske pasienter er ofte vanskelig å diagnostisere eller studere uten intervensjon. Videre benytter dyremodeller eller in vitro udødeliggjort cellelinje modeller for barn sykdommer som EoE omfatter ikke den eksakte sykdom patogenesen eller pasientspesifikke ^åtte forskjeller. Derfor er evnen til å studere en pasients sykdomsprosess in vitro for å identifisere spesifikke sykdoms utløsende antigener, evaluere underliggende mekanismene og undersøke medikamentell behandling ville være nye og tilveie klinikere med informasjon som kan hjelpe til med pasientbehandling.

Det har vært mange autologe eller pasient-spesifikke celletyper som har vært foreslått for bruk i tissue engineering og studere menneskelig sykdom patogenesen. Imidlertid er noen av disse celletyper er begrenset i deres evne til å generere nok celler av en spesifikk fenotype å pode en stor stillas eller utføre høy gjennomstrømning in vitro-studier. Bruken av pluripotent eller multipotente stamceller har vært tema for mye forskning diskusjon har imidlertid begrensninger og mangler for anvendelse av disse cellene er blitt godt beskrevet ^ni. Bruken av menneskelige embryonale stamceller er sterkt debattert og presenterer mange etiske problemstillinger. Viktigst er disse cellene danner teratomas, som er lik til en tumor, hvis de ikke er differensiert fra sin pluripotent tilstand forut for å levere dem til en levende vert ^10. Videre vil bruk av embryonale stamceller ikke være pasientspesifikk og kan utløse en allogen respons og behovet for immunsuppresjon ^10. Induserte pluripotente stamceller (iPSCs) er pluripotente celler som kanvære avledet fra en pasients egne celler. Somatiske celler, slik som hudceller, kan bli indusert til en pluripotent tilstand ved hjelp av en rekke integrerende og ikke-integrerende teknikker. Disse cellene deretter tjene som en pasient-spesifikke celle kilder for tissue engineering eller sykdom etterforskning. Integreringen av uønsket genetisk materiale inn i disse cellene er en bekymring mange har beskrevet og selv om sekvenser er helt fjernet iPSCs synes å bevare en epigenetisk "minne" mot celletype som de ble hentet ^11. Disse cellene også vil danne teratomas in vivo hvis ikke differensiert før transplantasjon ^11. Mange differensierings protokoller er blitt undersøkt med fokus på epitel-linjene ^{12, 13, 14,} men det er meget viktig å merke seg at de celletyper som resulterer i enden av differensiering er ikke homogen og oare ha en brøkdel av den celletype av interesse. Dette resulterer i lavt utbytte og behovet for å rense den ønskede celletype. Selv iPSCs er en potensiell pasient-spesifikke celle kilde, til prosessen få en celle type interesse for enten tissue engineering eller sykdom etterforskning er svært ineffektiv.

Humane epitelceller har blitt isolert fra et utvalg av både syke og ikke-sykt vev i menneskekroppen inkludert: lunge ^15, bryst ^{16, 17} tynntarm, tykktarm ^18, blære ¹⁹ og spiserøret ^20. Det er viktig å merke seg at humane primære celler har et endelig antall av passasjer i hvilken fenotype opprettholdes ^{21, 22.} Uheldigvis betyr dette at antall celler som er nødvendig for sykdom undersøkelse eller for såing en konstruert stillasetfor implantering kan ikke oppnås. Derfor er nye teknikker for å utvide pasientens celler samtidig opprettholde en epitelial fenotype. Betinget omprogrammering av normale og kreft epitelceller utnytte mater celler og ROCK inhibitor ble beskrevet i 2012 av Liu et al. ^{2 3.} Denne teknikken ble brukt til å utvide kreft epitelceller hentet fra biopsi av prostata og brystkreft ved bruk av bestrålte feeder-celler, ROCK hemmer og betinget omprogrammering middels. Målet var å generere nok celler for in vitro-analyser for eksempel narkotika screening. Denne teknikken er i stand til å utvide epitelceller på ubestemt tid med "omprogrammering" disse cellene til en stilk eller progenitor-lignende tilstand, som er svært proliferativ. Det har vist seg at disse cellene er ikke-tumorgene og ikke har evnen til å danne teratomas ^{23, 24.} Videre nokromosomavvik eller genetiske manipulasjoner var til stede etter aging disse cellene i kultur ved hjelp av denne teknikken ^{23, 24.} Viktigst av disse cellene er bare i stand til å differensiere til den opprinnelige celletype av interesse. Derfor er denne teknikken har et stort reservoar av pasientspesifikke epitelceller for sykdom undersøkelse eller regenerering av vev uten behov for immortalisering.

Innhenting av epitelvev fra et spesifikt organ for å studere sykdomsprosesser er ofte begrenset, og ikke alltid er mulig på grunn av pasient risiko. For de pasienter som lider av esophageal sykdom eller mangler, er endoskopisk biopsi henting en minimal invasiv metode for oppnåelse av epitelvev som kan bli dissosiert og betinget omprogrammeres for å tilveiebringe en ubegrenset kilde celle som er spesifikk for slimhinnene i den pasienten spiserøret. Dette gir da for in vitro-studierav epitelcellene til å evaluere sykdomsprosesser og skjerm for potensielle terapeutiske midler. En sykdom som kan ha stor nytte av denne tilnærmingen er Eosinofil Øsofagitt, som har blitt beskrevet som allergisk sykdom i spiserøret ^8. Allergi tester samt terapeutiske tilnærminger kan vurderes in vitro ved hjelp av pasientens egne epitelceller og disse dataene kan deretter sendes ut på behandlende lege for å utvikle tilpassede behandlingsplaner. Teknikken med betinget omprogrammering i forbindelse med innhenting av endoskopiske biopsier fra pediatriske pasienter gir mulighet til å utvide normale esophageal epitelceller ubestemt tid fra en pasient. Denne cellekilde kan derfor bli slått sammen med naturlig eller syntetisk stillas for å tilveiebringe en pasientspesifikk kirurgisk alternativ for defekter, sykdom eller traumer. Å ha en ubestemt celle nummer vil hjelpe ingeniør esophageal konstruksjoner som besitter en helt reseededlumen med esophageal epitelceller for å bidra til å lette regenereringen av de gjenværende celletyper.

Protocol

Esophageal biopsier ble oppnådd etter at informert samtykke er innhentet fra foreldre / foresatte til de pediatriske pasienter og i samsvar med Institutional Review Board (IRB # 13-094). 1. sterilisering Instrumenter og Gelatin Solution Autoclave tang, barberblad og saks før håndtering vev for å hindre forurensning. For å gjøre 200 mL av 0,1% gelatin-oppløsning, kombinere 200 ml destillert vann med 0,2 g gelatin. Autoklav og avkjøle før bruk. 2. Coat…

Representative Results

Et sammendrag av de viktigste trinnene i å isolere esophageal epitelceller fra pasient biopsier er oppsummert i figur 1. Kolonier av epitelceller vil dannes i løpet av ca. 4-5 dager, og vil bli omgitt av fibroblast feeder-celler (figur 2A). Ettersom disse koloniene utvide de vil fusjonere med andre kolonier for å danne større kolonier (figur 2B). Når kulturer har blitt 70% sammenflytende, de trenger å bli utvidet (Figur 2C)…

Discussion

De viktigste trinnene for å isolere og utvide esophageal epitelceller fra pasient biopsier er: 1) tilstrekkelig dissociating vevsprøver med minimal celledød; 2) sørge for ROCK inhibitor blir tilsatt til cellekulturmediet ved hver utskiftning av medium; 3) Ikke bruk flere mater celler enn anbefalt; 4) opprettholde en ren aseptisk kultur; og 5) passasje cellene like før nå samløpet.

På grunn av de pasientrelaterte forskjeller i biopsiprøver innhentet for betinget omprogrammering, er d…

Materials

Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15ml Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50ml Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658