Villkorlig Omprogrammering av Pediatric Human Esophageal epitelceller för användning i Tissue Engineering and Disease Investigation

Summary

Utbyggnad av mänskliga pediatriska esofagus epitelceller som utnyttjar villkorad omprogrammering ger utredarna med en patient specifik population av celler som kan användas för att konstruera matstrupen konstruktioner för autolog implantation för behandling av defekter eller skada och fungerar som en reservoar för terapeutiska screeningsanalyser.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

Matstrupen vävnadsteknik och eosinofil esofagit (EoE) har varit i fokus för forskning i många laboratorier under det senaste decenniet. Medfödda defekter, såsom esofagusatresi, ses i cirka 1 i 4000 levande födda, vilket resulterar i ofullständig utveckling i matstrupen som leder till oförmåga att äta ^en. Incidensen och prevalensen av EoE har varit på uppgång sedan identifiering av sjukdomsbegrepp 1993. Förekomsten av EoE varierade från 0,7 till 10 / 100.000 per årsverke och prevalensen varierade från 0,2 till 43 / 100.000 ^2. En ny attraktiv kirurgisk metod för behandling av långa gap esofagusatresi består i att generera vävnadskonstrukten för implantering med användning av patientens egna celler. Dessa celler i kombination med syntetiska byggnadsställningar kommer att generera en autolog konstruktion som inte kräver immunsuppression. Vissa grupper har redan börjat undersöka osse stamliknande celler för esofageal tissue engineering ³ såväl som användningen av nativa esofagus epitelceller för att återbefolka slemhinnan ^4-7. Sjukdomar som finns i matstrupen av pediatriska patienter är ofta svåra att diagnostisera eller studera utan ingripande. Dessutom använder djurmodeller eller in vitro odödlig cellinje modeller för barnsjukdomar som EoE omfattar inte den exakta sjukdomen patogenes eller patientspecifika skillnader ^8. Därför är förmågan att studera en patients sjukdomsprocessen in vitro i syfte att identifiera specifika sjukdoms utlösande antigener, utvärdera underliggande mekanismerna och undersöka läkemedelsbehandlingar skulle vara nytt och ge kliniker med information som kan underlätta patientbehandling.

Det har funnits många autologa eller patientspecifika celltyper som har föreslagits för användning i tissue teknik och studera mänskliga sjukdomar patogenes. Emellertid vissa av dessa celltyper är begränsade i sin förmåga att alstra tillräckligt med celler av en viss fenotyp för att ympa en stor byggnadsställning eller utföra hög genomströmning in vitro-studier. Användningen av pluripotenta eller multipotenta stamceller har varit föremål för mycket forskning diskussion, dock begränsningar och tillkortakommanden för att använda dessa celler har beskrivits väl ^9. Användningen av mänskliga embryonala stamceller är mycket diskuteras och presenterar många etiska frågor. Viktigast dessa celler bildar teratom, som liknar en tumör, om de inte skiljer sig från deras pluripotent tillstånd före att leverera dem till en levande värd ^10. Dessutom skulle användningen av embryonala stamceller inte vara patientspecifika och kan framkalla en allogen svar och behovet av immunsuppression ^10. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är pluripotenta celler som kanhärledas från en patients egna celler. Somatiska celler, såsom hudceller, kan induceras att ett pluripotent tillstånd genom att använda en variation av integrativa och icke-integrativa tekniker. Dessa celler fungerar sedan som en patientspecifika cellkällor för vävnadsteknik eller sjukdomsundersökning. Integrationen av oönskat genetiskt material in i dessa celler är ett bekymmer många har beskrivits och även om sekvenserna är fullständigt avlägsnade iPSCs tycks bevara en epigenetisk "minne" i riktning mot den celltyp från vilken de var härledda ^11. Dessa celler kommer också att bilda teratom in vivo om inte differentierade före transplantation ^11. Många differentieringsprotokoll har undersökts med fokus på epiteliala härstamningar ^{12, 13, 14,} är det dock mycket viktigt att notera att de celltyper som resulterar i slutet av differentiering inte är homogena och only besitter en bråkdel av celltypen av intresse. Detta resulterar i lågt utbyte och behovet av att rena den önskade celltypen. Även iPSCs är en potentiell patientspecifik cellkälla, till processen få en celltyp av intresse för antingen tissue engineering eller sjukdomsundersökning är mycket ineffektivt.

Humana epitelceller har framgångsrikt isolerats från en mängd av både sjuka och icke-sjuk vävnad i människokroppen inklusive: lunga ^15, bröst ^16, tunntarm ^17, kolon ^18, urinblåsa ¹⁹ och matstrupen ^20. Det är viktigt att notera att humana primära celler har ett ändligt antal passager i vilka fenotypen upprätthålls ^{21, 22.} Tyvärr innebär detta att antalet celler som behövs för sjukdomsundersökning eller sådd en konstruerad byggnadsställningför implantation inte kan uppnås. Därför är nya tekniker som behövs för att expandera patientceller och samtidigt bibehålla en epitelial fenotyp. Villkorlig omprogrammering av normala och cancer epitelceller utnyttjar matarceller och ROCK-inhibitor beskrevs 2012 av Liu et al. ^{2 3.} Denna teknik användes för att expandera cancerous epitelceller erhållna från biopsier av prostata- och bröstcancer med användning av bestrålade matarceller, ROCK-inhibitor och villkorlig omprogrammering medel. Målet var att skapa tillräckligt med celler för in vitro-analyser såsom läkemedelsscreening. Denna teknik är i stånd att expandera epitelceller obestämd tid genom "omprogrammering" dessa celler till en stam eller stamfader-liknande tillstånd, som är mycket proliferativ. Det har visats att dessa celler är icke-tumörframkallande och inte har förmågan att bilda teratom ^{23, 24.} Dessutom ingenkromosomavvikelser eller genetiska manipulationer var närvarande efter passage dessa celler i odling med hjälp av denna teknik ^{23, 24.} Viktigast av allt, dessa celler kan bara att differentieras till den nativa celltypen av intresse. Därför erbjuder denna teknik en stor reservoar av patientspecifika epitelceller för sjukdomsundersökning eller vävnadsteknik utan behov av odödliggörande.

Erhålla epitelvävnad från ett visst organ för att studera sjukdomsprocesser är ofta begränsad och inte alltid möjligt på grund av patientens risk. För de patienter som lider av matstrupen sjukdom eller brister, är endoskopisk biopsi hämtning en minimalinvasiv metod för att erhålla epitelvävnad som kan skiljas och villkorligt omprogrammeras för att ge en obestämd cellkälla som är specifik för slemhinnan i det patientens matstrupe. Detta möjliggör sedan för in vitro-studierav epitelcellerna att utvärdera sjukdomsprocesser och skärm för potentiella läkemedel. En sjukdomsprocess som i hög grad skulle kunna dra nytta av denna metod är Eosinophilic Esofagit, som har beskrivits som allergisk sjukdom i matstrupen ^8. Allergitester samt terapeutiska metoder kan utvärderas in vitro med hjälp av patientens egna epitelceller och dessa data kan sedan föras till den behandlande läkaren att utveckla individuella behandlingsplaner. Tekniken av villkorad omprogrammering i samband med att erhålla endoskopiska biopsier från pediatriska patienter ger möjlighet att expandera normala esofagus epitelceller på obestämd tid från någon patient. Denna cellkälla kan därför slagit ihop med naturliga eller syntetiska byggnadsställningar att tillhandahålla en patientspecifik kirurgiskt alternativ för defekter, sjukdom eller trauma. Med en obestämd celltal skulle bidra till ingenjör esofagus konstruktioner som besitter en helt reseededlumen med esofageala epitelceller för att hjälpa till att underlätta regenerering av de återstående celltyper.

Protocol

Esofagus biopsier erhölls efter informerat samtycke erhölls från föräldrar / vårdnadshavare för pediatriska patienter och i enlighet med Institutional Review Board (IRB # 13-094). 1. sterilisering av instrument och gelatinlösning Autoklav pincett, rakblad och saxar före hantering vävnad för att förhindra förorening. För att göra 200 ml 0,1% -ig gelatinlösning, kombinera 200 ml destillerat vatten med 0,2 g gelatin. Autoklavera och sval före användning. <p class="jo…

Representative Results

En sammanfattning av de viktigaste stegen i att isolera esofagus epitelceller från patientbiopsier sammanfattas i figur 1. Kolonier av epitelceller bildas i ungefär 4-5 dagar och kommer att omges av fibroblast feeder-celler (Figur 2A). Eftersom dessa kolonier expandera de kommer att slås samman med andra kolonier att bilda större kolonier (Figur 2B). När kulturerna har blivit 70% sammanflytande, måste de utökas (figur 2C)….

Discussion

De viktigaste stegen för att isolera och expandera esofagus epitelceller från patientbiopsier är: 1) på lämpligt sätt dissociera biopsivävnad med minimal celldöd; 2) säkerställa ROCK-inhibitor tillsätts till cellodlingsmediet vid varje mediumbyte; 3) Använd inte fler matarceller än rekommenderas; 4) upprätthålla en ren aseptisk kultur; och 5) passage celler strax före att nå sammanflödet.

På grund av de patientrelaterade skillnader i biopsiprover erhållna för villkorlig …

Materials

Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15ml Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50ml Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658