Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

Summary

Hier presenteren we een protocol voor een mozaïek labeling techniek die de visualisatie van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke voorlopercel in twee verschillende kleuren mogelijk maakt. Dit vergemakkelijkt neurale stam analyse met de mogelijkheid van geboorte uit individuele neuronen en studeren genfunctie in dezelfde neuronen verschillende individuen.

Abstract

M osaic bestudeert de analyse met een r epressible c ell m Arker (MARCM) is een positief mozaïek etikettering systeem dat op grote schaal in Drosophila neurobiologische studies heeft toegepast op ingewikkelde morfologie verbeelden en om de functie van genen in subsets van neuronen in anderszins ongemarkeerde en onverstoorbaar te manipuleren organismen. Genetische mozaïeken gegenereerd in het systeem MARCM uitgeoefend via plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen in delende voorlopercellen zowel gemerkt (MARCM klonen) en ongemarkeerde dochter cellen tijdens mitose. Een uitbreiding van de MARCM methode, genaamd tweeling ter plaatse MARCM (tsMARCM), label beide twee cellen afkomstig van een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren. Deze techniek werd ontwikkeld voor het opvragen van nuttige informatie van beide hemi-lineages inschakelen. Door uitvoerig analyseren van verschillende paren tsMARCM klonen, het tsMARCM systeem maakt hoge-resolutie neurale afkomst mapping om de exacte geboorte-orde van de gelabelde neuronen geproduceerd uit gemeenschappelijke voorlopercellen te onthullen. Bovendien is het systeem tsMARCM zich ook genfunctie studies door toe de fenotypische analyse van identieke neuronen van verschillende dieren. Hier beschrijven we hoe u de tsMARCM systeem om studies van de ontwikkeling van het zenuwstelsel in Drosophila bevorderen toe te passen.

Introduction

De hersenen, bestaande uit een groot aantal en verschillende soorten neuronen, begiftigt dieren de mogelijkheid om waar te nemen, te verwerken en te reageren op de uitdagingen van de buitenwereld. Neuronen van de volwassen Drosophila centrale hersenen zijn afgeleid van een beperkt aantal neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI), tijdens de ontwikkeling ^{1, 2.} Het grootste deel van de AI's die deelnemen aan de hersenen neurogenese in Drosophila ondergaan asymmetrische divisie zelf-vernieuwing NBs en ganglion moeder cellen (GMC's) te genereren, en de GMC ga dan via een andere ronde van de divisie twee dochter cellen die differentiëren tot neuronen ³ te produceren (Figuur 1A ). Vanwege de complexiteit van neuronale morfologie en de uitdagingen in verband met het identificeren van specifieke neuronen, een positieve mozaïek labeling technologie, mozaïek analyse met een onderdrukbare cel marker (MARCM), werd uitgevonden om het mogelijk te maken visualization van een enkel neuron of een klein deel van neuronen uit van de bevolking van de omgeving, niet-gemerkte neuronen ^4.

MARCM gebruikt de flippase (FLP) / FLP beeldherkenning (FRT) systeem plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen bemiddelen bij een scheidslijn voorlopercel die een heterozygote allel van een repressor gen, waarvan de expressie normaal remt de expressie van een reportergen ^4. Na de mitotische deling, worden de recombinante chromosomen gescheiden in twee cellen, zodanig dat één cel homozygote allelen van het repressor-gen en de andere cel geen repressor gen de expressie van het in die cel (en de nakomelingen) niet langer ⁴ geblokkeerd. Drie klonen patronen zijn meestal te vinden in een MARCM experiment wanneer FLP stochastisch wordt geïnduceerd in NBs of GMC's: single-cell en twee-cell-GMC-klonen, die neuronale morfologie bij single-cell resolutio verbeeldenn en meercellige NB-klonen, die volledige morfologische patronen van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke NB (Figuur 1B) tonen. De MARCM techniek is op grote schaal toegepast in Drosophila neurobiologische studies, waaronder in neuronale typeaanduiding voor het reconstrueren van brain-breed bedrading netwerken, neurale afkomst analyses voor de openbaarmaking van de ontwikkelingsgeschiedenis van neuronen, fenotypische karakterisatie van genfuncties betrokken bij het lot van de cel specificatie en neuronale morfogenese en differentiatie studies ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Omdat conventionele MARCM alleen etiketten één van de twee dochtercellen (en lijnen) na de geïnduceerde mitotische recombinatie evenement wordt mogelijk nuttige informatie uit de vrijstaande kant verloren. Deze beperking verzet tegen de toepassing van de fundamentele MARCM systeem om hoge-resolutie analyse van de vele neurale geslachten die cel lot te schakelen in snel tempo of precisie analyses van gen functies in dezelfde neuronen van verschillende dieren ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) is een geavanceerd systeem dat neuronen afkomstig uit een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren etiketten, waarbij de terugwinning van nuttige informatie uit beide zijden van de twee cellen mogelijk maakt, waardoor de beperking van het oorspronkelijke MARCM systeem ¹¹ (overwinnen Figuur 2A – 2C). In het tsMARCM systeem, twee RNA interferentie (RNAi) gebaseerde dempers liggen op trans-plaatsen van homologe chromosomen in een voorlopercel en de expressie van de suppressors de expressie van hun respectieve reporters (figuur 2B) onafhankelijk remmen. Naar aanleiding van site-specific mitotische recombinatie gemedieerd door de FLP / FRT-systeem, de two RNAi-gebaseerde suppressors worden gescheiden in twee cellen om de expressie van verschillende reporters (figuur 2B) toe. Twee klonale patronen, eencellige geassocieerd met eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige NB-klonen, worden typisch gezien in een tsMARCM experiment (figuur 2C). Informatie afkomstig van de ene kant van de twee cellen kan worden gebruikt als referentie voor de andere zijde, waardoor een hoge-resolutie neurale stam analyses, zoals geboorte uit het gemerkte neuronen en fenotypische analyses van dezelfde neuronen verschillende dieren nauwkeurig onderzoek van neurale genfunctie ^{11, 12.} Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol beschrijft hoe een tsMARCM experiment, dat door andere laboratoria kunnen worden gebruikt om hun onderzoek van neurale ontwikkeling verbreden voeren (alsook de ontwikkeling van andere weefsels, indien van toepassing) in Drosophila.

Protocol

1. Build tsMARCM-ready Vliegen met de juiste transgenen 11, 13 Genereer de originele versie van tsMARCM-ready vliegt van transgenen die worden gedragen door de individuele vliegen 11 (zie tabel 1). Gedrag standaard fly genetische kruising regelingen, die eerder zijn beschreven, door de invoering van meerdere transgenen in dezelfde fly voorraden 13. In één ouderlijn Monteer de …

Representative Results

Het tsMARCM systeem is gebruikt om neurale lineage analyses en genfunctie studies vergemakkelijkt door het ophalen van belangrijke informatie over neuronen afgeleid van gemeenschappelijke NBs. Het systeem is gebruikt om de meeste (zo niet alle) neurontypen zijn en stelt het aantal cellen per neuronale typen en gaat na geboorte-volgorde van deze neuronen 11, 12, 18 (zie de bespreking voor…

Discussion

Kritische stappen in het protocol

Stappen 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 en 3.2 zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van goede tsMARCM resultaten. Weefsel-specifieke -GAL4 drivers die niet GAL4 in neurale voorlopers tot expressie brengen hebben de voorkeur voor de stappen 1.1.1 en 1.2.1. Vermijd overbevolking van de dieren gekweekt in de fly-food flesjes in stap 2.3. Omdat de inductie latentie, het expressieniveau van FLP upon heat-shock en de gemiddelde verdelen tijdstip van neurale v…

Materials

Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75×25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones