쌍둥이 자리 MARCM를 사용하여 세포 계보 분석 및 유전자 기능 연구
Summary
여기서 우리는 두 가지 색상으로 일반 전구 세포에서 파생 된 신경 세포의 시각화를 허용하는 모자이크 라벨 기술에 대한 프로토콜을 제시한다. 이것은 다른 사람의 동일한 뉴런에서 출생 데이트 개별 뉴런의 기능과 공부 유전자 기능과 신경 계통 분석을 용이하게한다.
Abstract
M은 R의 epressible C의 엘 m 개의 arker와 nalysis (MARCM) 널리 복잡 모폴로지를 도시하고, 그렇지 않으면 표시되지 않은 및 교란 내 뉴런의 서브 세트에서 유전자의 기능을 조작하는 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어 포지티브 모자이크 표시 시스템이다 osaic 생물. MARCM 시스템에서 발생하는 유전 모자이크는 유사 분열하는 동안 모두 표시 (MARCM 클론) 및 표시되지 않은 딸 세포를 생성하는 전구 세포를 분할 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 통해 매개된다. MARCM 방법의 확장이라는 쌍둥이 자리 MARCM (tsMARCM)는, 두 가지 색상으로 공통 조상에서 유래 쌍둥이 세포의 두 레이블. 이 기술은 모두 헤미 계통에서 유용한 정보의 검색을 가능하게하기 위해 개발되었다. 종합적 tsMARCM 클론의 다른 쌍을 분석함으로써, tsMARCM 시스템은 고해상도 신경 계통 mappin 허용g는 일반 전구 세포에서 생성 된 레이블 뉴런의 정확한 출생 순서를 공개합니다. 또한, tsMARCM 시스템은 또한 다른 동물 동일한 뉴런 표현형 분석을 허용하여 유전자 기능 연구를 확장한다. 여기, 우리는 초파리에서 신경 발달의 연구를 용이하게하기 위해 tsMARCM 시스템을 적용하는 방법에 대해 설명합니다.
Introduction
방대한 수의 뉴런 다양한 형태로 구성 뇌가, 지각 처리와 외부 세계로부터의 도전에 대응하는 능력을 동물 부여한다. 성인 초파리 중앙 뇌의 신경 세포는 신경 줄기 세포의 수가 제한으로부터 유도되는 현상 (1, 2) 동안 호출 neuroblasts (NBS). 새로운 기지국이 초파리의 뇌 신경에 참여하는 대부분의 자기 갱신 NBS 및 신경절 어머니 세포 (GMCs)를 생성하는 비대칭 분열을 받아야하고, GMCs는 (그림 1A를 신경 세포 3로 분화 두 개의 딸 세포를 생산하는 부문의 또 다른 라운드 통과 ). 때문에 신경 형태의 복잡함과 특정 신경 세포, 긍정적 인 모자이크 레이블 기술하는 repressible 세포 마커 (MARCM) 모자이크 분석을 식별과 관련된 문제의의 visualizat 수 있도록 발명되었다하나의 신경 세포 또는 주변, 레이블이없는 뉴런 (4)의 인구 중 신경 세포의 작은 부분 집합의 이온.
MARCM는 flippase (FLP) 식 일반적으로 리포터 유전자 4의 발현을 억제하는 리프레 서 유전자의 이형 접합 대립 유전자를 운반하는 분할 전구 세포 내에서 상동 염색체 사이의 부위 특이 적 재조합을 중재하기 / FLP 인식 대상 (FRT) 시스템을 사용합니다. 유사 분열 분할 한 후, 재조합 염색체가 더 이상없는 하나의 셀은 동형 접합 리프레 유전자의 대립 유전자와 다른 세포가 더 리프레 서 유전자 – 더 그 셀 (및 그 자손)에 기자의 발현이 없습니다를 포함하도록, 트윈 세포로 분리된다 (4)를 차단했습니다. FLP가 확률 적 NBS 또는 GMCs 유도 할 때 세 가지 클론 패턴은 일반적으로 MARCM 실험에서 발견된다 : 단일 셀 resolutio에서 신경 세포의 형태를 묘사 단일 셀 및 2 셀 – GMC 클론을,일반적인 NB (그림 1B)에서 파생 된 신경 세포의 전체 형태 학적 패턴을 보여 n 및 다세포-NB 클론. MARCM 기술이 널리 뇌 전체의 배선 네트워크를 재구성 신경 유형 식별을 포함하여, 초파리 신경 생물학적 연구에 적용되어, 신경 계통은 신경 세포 운명 사양에 관여하는 유전자의 기능 표현형 특성의 개발 역사를 공개에 대해 분석하고, 신경 세포의 형태 형성 분화는 5, 6, 7, 8, 9, 10 연구. 종래 MARCM 만 유도 분열 재조합 이벤트 이후 개의 딸세포 (및 계통) 중 한 라벨 때문에, 표시되지 않은 측면에서 잠재적으로 유용한 정보가 손실된다. 이 제한은 기본 M의 적용을 배제고해상도로 ARCM 시스템은 빠른 템포 세포 운명 전환 많은 신경 계통 분석 또는 다른 동물 정밀도 11, 12의 동일한 뉴런 유전자 기능 분석한다.
트윈 스폿 MARCM (tsMARCM)는 이렇게 원래 MARCM 시스템 (11)의 한계 (극복 트윈 셀의 양측에서 유용한 정보의 회복을 가능하게 두 개의 별개의 색상이 공통 조상으로부터 유래 신경 라벨 고급 시스템이다 그림 2A – 2C). tsMARCM 시스템에서, 두 개의 RNA 간섭 (RNAi) 억제제는 전구 세포 내에서 상동 염색체의 트랜스 위치에 놓인다 기반, 이러한 억제제의 발현이 독립적으로 각각의 기자 (도 2B)의 발현을 억제한다. FLP / FRT 시스템을 통해 매개되는 부위 특이 적 분열 재결합 후, TWO가 RNAi를 기반 억제 별개 기자 (도 2B)의 발현을 허용하는 트윈 세포로 분리. 두 클론 패턴 다세포-NB 클론과 연관된 단일 세포 클론과 두 셀 GMC와 연관된 단일 셀은 전형적 tsMARCM 실험 (도 2c)에서 볼 수있다. 정보는 출생 데이트 표지 뉴런 신경 혈통 분석 고해상도를 가능 타측에 대한 기준으로서 이용 될 수있는 트윈 셀의 한쪽에서 유래하고, 표현형은 정확한 조사 다른 동물에서 동일 뉴런 분석 신경 유전자 기능 (11), (12). 여기서, 우리는 (가능한 경우뿐만 아니라, 다른 조직의 발달) 초파리 신경 발달 공부 범위를 확장하기 위해 다른 실험실에서 사용될 수있는 tsMARCM 실험을 수행하는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 내에서 중요한 단계
2.5, 2.3, 1.2.1, 1.1.1 단계, 3.2 좋은 tsMARCM 결과를 얻기위한 중요합니다. 신경 전구 세포에서 GAL4을 표현하지 않는 조직 별 -GAL4 드라이버 단계 1.1.1과 1.2.1 바람직하다. 단계 2.3에서 플라이 식품 유리 병에서 자란 동물을 과도하게 몰려 마십시오. 유도 지연, 열충격시 FLP의 발현 수준 및 신경 전구 세포 (즉, 새로운 기지국과 GMCs)의 평균 분할…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 과학 기술부에 의해 지원되었다 (MOST 104-2311-B-001-034)과 세포 연구소 유기체 생물학, 중앙 연구원, 대만.
Materials
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75×25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No.1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25°C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37°C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., Image-J) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
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