Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Summary

Здесь мы приводим протокол для мозаичной техники маркировки, которая позволяет визуализировать нейронов, полученных из общей клетки-предшественника в двух различных цветах. Это облегчает нейронную анализ клонов с возможностью рождения-знакомства отдельных нейронов и изучения функции гена в одних и тех же нейронов разных людей.

Abstract

M osaic в НАЛИЗ с г epressible с ELL м arker (MARCM) является положительным система маркировки мозаики, которая широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований , чтобы изобразить сложные морфологию и манипулировать функции генов в подмножества нейронов в противном случае без опознавательных знаков и невозмущенной организмы. Генетические мозаики, генерируемые в системе MARCM опосредуется через сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами в пределах деления клеток-предшественников, чтобы производить как отмеченные знаком (MARCM клоны) и немаркированные дочерние клетки во время митоза. Расширение метода MARCM, называемый твин-спот MARCM (tsMARCM), этикетки и сдвоенных клеток, полученных от общего предка с двумя разными цветами. Этот метод был разработан для того, чтобы извлекать полезную информацию из обоих Hemi-родословных. Путем всестороннего анализа различных пар tsMARCM клонов, система tsMARCM позволяет высокого разрешения нейронального происхождения MAPPINг выявить точное порядка рождения меченых нейронов, полученных из обычных клеток-предшественников. Кроме того, система tsMARCM также расширяет исследования функции гена, позволяя фенотипический анализ идентичных нейронов различных животных. Здесь мы опишем , как применять систему tsMARCM , чтобы облегчить изучение развития нервной системы у дрозофилы.

Introduction

Мозг, состоящий из огромного количества разнообразных и типов нейронов, жертвует животных со способностью воспринимать, обрабатывать и реагировать на вызовы от внешнего мира. Нейроны взрослого Drosophila центрального мозга получают из ограниченного количества нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (NBS), в течение развития ^{1, 2.} Большинство НБС участвующих в нейрогенез головного мозга у дрозофилы проходят асимметричное деление для генерации самообновляющихся NBS и ганглий материнские клетки (GMCS), и GMCs затем пройти через еще один раунд разделения , чтобы произвести две дочерние клетки , которые дифференцируются в нейроны ³ (рис 1А ). Из-за запутанности нейронного морфологии и проблемы, связанные с определением конкретных нейронов, положительно мозаичную технологии маркировки, мозаика анализ с репрессируемый клеток маркером (MARCM), был изобретен для того, чтобы visualizatион одного нейрона или небольшой группы нейронов из популяции окружающих, немеченых нейронов ^4.

MARCM использует флиппазы (FLP) / ФЛП целевой системы распознавания (FRT) посредничать сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами внутри клетки – предшественника разделяющая несущего гетерозиготную аллель гена репрессора, экспрессия которого обычно ингибирует экспрессию гена – репортера ^4. После того, как митотического деления, рекомбинантные хромосомы разделены на близнецов клетки, таким образом, что одна клетка содержит гомозиготные аллели гена репрессора и другая ячейка не имеет репрессор гена-экспрессию репортера в этой ячейке (и его потомков) больше не является ⁴ заблокирован. Три клоновых узоры обычно встречаются в MARCM эксперименте, когда ФЛП стохастически индуцируется в NBS или ГМО: одноклеточные и двухкамерные-GMC клоны, которые изображают нейронную морфологию в одноклеточных Resolutioп, и многоклеточные-NB клонов, раскрывающие целые морфологические закономерности нейронов , происходящих от общего NB (рис. 1В) Методика MARCM широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований, в том числе в идентификации нейронов типа для реконструкции мозга по всей проводки сетей, нейронная линия анализа для раскрытия истории развития нейронов, фенотипической характеризации генов функций , участвующих в спецификации клеточных судеб, и нейронный морфогенез и дифференциация изучает ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Поскольку обычные MARCM только этикетки одну из двух дочерних клеток (и родословных) после индуцированного события митотической рекомбинации, потенциально полезной информации от немаркированной стороны теряется. Это ограничение исключает применение основного МСистема ARCM с высокой разрешающей способностью анализа многих нейронных линий , которые переключают клеточные судьбы в быстром темпе или точности анализа функций генов в одинаковых нейронов различных животных ^{11, 12.}

Twin-спот MARCM (tsMARCM) представляет собой развитую систему , которая маркирует нейроны , полученные от общего предка с двумя различными цветами, что делает возможным восстановление полезной информации с обеих сторон близнецов клеток, таким образом преодолевая ограничения исходной системы MARCM ¹¹ ( Фигура 2А – 2С). В системе tsMARCM, две РНК – интерференция (RNAi) основе супрессоры расположены в транс-сайтов гомологичных хромосом в клетке – предшественника, и экспрессию этих супрессоров независимо друг от друга ингибируют экспрессию соответствующих репортеров (Фигура 2В). После сайт-специфической рекомбинации митотического опосредованное через систему FLP / FRT, то ТВто RNAi основе супрессоры стали разделены на две односпальные клетки , чтобы разрешить экспрессию различных репортеров (рис 2В). Два клоновых модели, одноклеточные , связанные с одноклеточных клонах и двуклеточной-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов, как правило , рассматривается в эксперименте tsMARCM (рис 2C). Информация, полученная от одной стороны сдвоенных ячеек могут быть использованы в качестве ссылки на другую сторону, что позволяет с высокой разрешающей способностью анализов нейронального происхождения, такие как рождение датирующим меченых нейронов, и фенотипический анализ идентичных нейронов у различных животных для точного расследования нейронной функции гена ^{11, 12.} Здесь мы приводим протокол шаг за шагом , описывающий , как провести эксперимент tsMARCM, который может быть использован в других лабораториях , чтобы расширить свои исследования развития нервной системы (а также развитие других тканей, если это применимо) у дрозофилы.

Protocol

1. Построить tsMARCM готовый Мухи с использованием требуемой трансгенов 11, 13 Сформировать оригинальную версию tsMARCM-готовых мух от трансгенов, которые выполняются отдельными мухами 11 (таблица 1). Проведение стандартных генетически…

Representative Results

Система tsMARCM была использована для облегчения нейронального происхождения анализов и исследований функции генов путем извлечения важной информации о нейронов, происходящих от общих NBS. Система была использована для идентификации большинство (если не все) нейронные ?…

Discussion

Критические шаги в рамках Протокола

Шаги 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, 3.2 и имеют решающее значение для получения хороших результатов tsMARCM. Тканеспецифические драйверы -GAL4 , которые не экспрессируют GAL4 в нервных клеток – предшественников являются предпочтительными для стадий 1.1.1 и 1.2….

Materials

Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75×25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones