सेल वंश विश्लेषण और जीन समारोह अध्ययन ट्विन मौके MARCM का प्रयोग
Summary
यहाँ, हम एक पच्चीकारी लेबलिंग तकनीक है कि दो अलग-अलग रंगों में एक आम पूर्वज सेल से निकाली गई न्यूरॉन्स के दृश्य के परमिट के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। यह अलग व्यक्तियों का एक ही न्यूरॉन्स में जन्म-डेटिंग व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की क्षमता और पढ़ाई जीन समारोह के साथ तंत्रिका वंश विश्लेषण की सुविधा।
Abstract
एम आर सी epressible पक्ष मीटर arker के साथ एक nalysis (MARCM) एक सकारात्मक पच्चीकारी लेबलिंग प्रणाली है कि व्यापक रूप से जटिल morphologies चित्रित करने के लिए और अन्यथा अगोचर और बेफिक्र भीतर न्यूरॉन्स के सबसेट में जीन के समारोह में हेरफेर करने के लिए ड्रोसोफिला neurobiological पढ़ाई में लागू किया गया है osaic जीवों। जेनेटिक MARCM प्रणाली में उत्पन्न मोज़ाइक अग्रदूत कोशिकाओं को विभाजित बँटवारा के दौरान दोनों चिह्नित (MARCM क्लोन) और अगोचर बेटी कोशिकाओं का उत्पादन करने के भीतर मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच साइट विशेष पुनर्संयोजन के माध्यम से मध्यस्थता कर रहे हैं। MARCM विधि का एक विस्तार है, कहा जाता जुड़वां मौके MARCM (tsMARCM), दो अलग-अलग रंगों के साथ एक आम पूर्वज से निकाली गई कोशिकाओं के जुड़वां दोनों लेबल। इस तकनीक को दोनों अर्ध-प्रजातियों से उपयोगी जानकारी की पुनर्प्राप्ति सक्षम करने के लिए विकसित किया गया था। द्वारा व्यापक tsMARCM क्लोन के विभिन्न जोड़े का विश्लेषण, tsMARCM प्रणाली उच्च संकल्प तंत्रिका वंश mappin परमिटजी आम पूर्वज कोशिकाओं से उत्पादित लेबल न्यूरॉन्स की सही जन्म के आदेश प्रकट करते हैं। इसके अलावा, tsMARCM प्रणाली को भी विभिन्न जानवरों के समान न्यूरॉन्स की प्ररूपी विश्लेषण की अनुमति से जीन समारोह के अध्ययन फैली हुई है। यहाँ, हम कैसे tsMARCM प्रणाली ड्रोसोफिला में तंत्रिका विकास के अध्ययन की सुविधा के लिए लागू करने का वर्णन है।
Introduction
मस्तिष्क, एक विशाल संख्या और न्यूरॉन्स के विविध प्रकार के शामिल, अनुभव, प्रक्रिया, और बाहरी दुनिया से चुनौतियों का सामना करने की क्षमता के साथ जानवरों endows। वयस्क ड्रोसोफिला केंद्रीय मस्तिष्क के न्यूरॉन्स, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं की एक सीमित संख्या से निकाली गई है बुलाया neuroblasts (एनबीएस), विकास 1, 2 के दौरान। NBs ड्रोसोफिला में मस्तिष्क न्यूरोजेनेसिस में भाग लेने के अधिकांश विषम विभाजन से गुजरना स्वयं renewing NBs और नाड़ीग्रन्थि मां कोशिकाओं (GMCs) उत्पन्न करने के लिए, और GMCs तो विभाजन के दूसरे दौर के माध्यम से जाना (चित्रा 1 ए दो बेटी कोशिकाओं है कि न्यूरॉन्स 3 में अंतर का उत्पादन करने के लिए )। न्यूरोनल आकृति विज्ञान की जटिलता और विशिष्ट न्यूरॉन्स, एक सकारात्मक पच्चीकारी लेबलिंग प्रौद्योगिकी, एक repressible सेल मार्कर (MARCM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण की पहचान के साथ जुड़े चुनौतियों की वजह से, visualizat सक्षम करने के लिए आविष्कार किया गया थाएक न्यूरॉन या आसपास, लेबल हटाया गया न्यूरॉन्स 4 की आबादी से बाहर न्यूरॉन्स के एक छोटे सबसेट के आयन।
MARCM flippase (FLP) / FLP मान्यता लक्ष्य (FRT) प्रणाली एक repressor जीन, जिनकी अभिव्यक्ति सामान्य रूप से एक पत्रकार जीन 4 की अभिव्यक्ति को रोकता है की एक विषमयुग्मजी एलील ले जाने के एक विभाजन अग्रदूत कोशिका के भीतर मुताबिक़ गुणसूत्रों के बीच साइट विशेष पुनर्संयोजन मध्यस्थता करने के लिए इस्तेमाल करता है। mitotic विभाजन के बाद, पुनः संयोजक गुणसूत्रों जुड़वां कोशिकाओं में अलग कर रहे हैं, जैसे कि एक सेल repressor जीन की homozygous alleles और अन्य सेल कोई repressor जीन है कि सेल (और उसके वंश) में रिपोर्टर की अभिव्यक्ति है शामिल नहीं रह गया है 4 जाम कर दिया। तीन प्रतिरूप पैटर्न आम तौर पर एक MARCM प्रयोग में पाया जाता है जब FLP प्रसंभात्य NBs या GMCs में प्रेरित किया है: एकल कोशिका और दो-सेल जीएमसी क्लोन है, जो एकल कोशिका resolutio पर न्यूरोनल आकृति विज्ञान को दर्शातीएन, और बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन है, जो एक आम एनबी (चित्रा 1 बी) से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की पूरी रूपात्मक पैटर्न प्रकट करते हैं। MARCM तकनीक का व्यापक रूप, ड्रोसोफिला neurobiological पढ़ाई में लागू किया गया है मस्तिष्क चौड़ा तारों के नेटवर्क के पुनर्निर्माण के लिए न्यूरोनल प्रकार पहचान में भी शामिल है, तंत्रिका वंश न्यूरॉन्स, सेल भाग्य विनिर्देश में शामिल जीन कार्यों की प्ररूपी लक्षण वर्णन के विकास के इतिहास खुलासा करने के लिए विश्लेषण करती है, और neuronal morphogenesis और भेदभाव अध्ययन 5, 6, 7, 8, 9, 10। क्योंकि पारंपरिक MARCM केवल दो बेटी कोशिकाओं (और प्रजातियों) प्रेरित mitotic पुनर्संयोजन घटना के बाद से एक लेबल, अगोचर तरफ से संभावित रूप से उपयोगी जानकारी खो दिया है। इस सीमा बुनियादी एम के आवेदन precludesउच्च संकल्प को ARCM प्रणाली कई तंत्रिका प्रजातियों कि तेज गति में सेल भाग्य स्विच का विश्लेषण करती है या सटीक करने के लिए विभिन्न जानवरों 11, 12 की समान न्यूरॉन्स में जीन कार्यों का विश्लेषण करती है।
ट्विन मौके MARCM (tsMARCM) एक उन्नत प्रणाली है कि दो अलग-अलग रंगों के साथ एक आम पूर्वज से निकाली गई न्यूरॉन्स लेबल, जो दो कोशिकाओं के दोनों ओर से उपयोगी जानकारी की वसूली के लिए सक्षम बनाता है, इस प्रकार मूल MARCM प्रणाली 11 की सीमा (पर काबू पाने के लिए है चित्रा 2A – 2 सी)। TsMARCM प्रणाली में, दो शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) आधारित दमन का पूर्वाभ्यास कोशिका के भीतर मुताबिक़ क्रोमोसोम के पार स्थलों पर स्थित हैं, और उन दमन की अभिव्यक्ति के लिए स्वतंत्र रूप से अपने संबंधित संवाददाताओं (चित्रा 2 बी) की अभिव्यक्ति को रोकती हैं। साइट विशेष mitotic पुनर्संयोजन FLP / FRT प्रणाली के माध्यम से मध्यस्थता के बाद, TWओ आरएनएआई आधारित बनने दमन जुड़वां कोशिकाओं में अलग अलग संवाददाताओं से (चित्रा 2 बी) की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए। दो प्रतिरूप पैटर्न, एकल कोशिका एकल कोशिका क्लोन और बहु-कोशिकीय-एनबी क्लोन के साथ जुड़े दो सेल जीएमसी के साथ जुड़े, आम तौर पर एक tsMARCM प्रयोग (चित्रा -2) में देखा जाता है। सूचना जुड़वां कोशिकाओं दूसरे पक्ष के लिए संदर्भ के रूप में उपयोग किया जा सकता है की एक तरफ से निकाली गई, उच्च संकल्प तंत्रिका वंश का विश्लेषण करती है, जैसे जन्म-डेटिंग लेबल न्यूरॉन्स के रूप में सक्षम करने, और प्ररूपी सटीक जांच के लिए विभिन्न जानवरों में समान न्यूरॉन्स का विश्लेषण करती है तंत्रिका जीन समारोह 11, 12 की। यहाँ, हम एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल कैसे (यदि लागू करने के साथ ही अन्य ऊतकों के विकास) ड्रोसोफिला में एक tsMARCM प्रयोग है, जो अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता तंत्रिका विकास की अपनी पढ़ाई को व्यापक बनाने का संचालन करने का वर्णन प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
1.1.1 कदम, 1.2.1, 2.3, 2.5, और 3.2 अच्छा tsMARCM परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऊतक विशेष -GAL4 ड्राइवरों कि तंत्रिका progenitors में GAL4 व्यक्त नहीं करते कदम 1.1.1 और 1.2.1 के लिए पस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा समर्थित किया गया (सबसे 104-2311-बी-001-034) और सेलुलर के संस्थान और organismic जीवविज्ञान, एकेडेमिया सिनिका, ताइवान।
Materials
| Carbon dioxide (CO2) | Local vendor | n.a. | Anesthetize flies |
| CO2 pad | Local vendor | n.a. | Sort, cross and transfer flies |
| 10x PBS pH 7.4 | Uniregion Bio-Tech (or other vendors) | PBS001 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | Fix fly brains |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Rinse, wash and immunostain fly brains |
| Normal goat | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | Immunostain fly brains |
| serum | |||
| Rat anti-mouse CD8 antibody | Invitrogen | MCD0800 | Immunostain fly brains |
| Rabbit anti-DsRed antibody | Clonetech | 632496 | Immunostain fly brains |
| Mouse anti-Brp antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11006 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunostain fly brains |
| Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21236 | Immunostain fly brains |
| SlowFade gold antifade reagent | Molecular Probes | S36936 | Mount fly brains and protect quenching of fluorescence |
| PYREX 9 depression glass spot plate | Corning | 7220-85 | Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments | SYLG184 | Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection |
| Activated charcoal | Sigma-Aldrich | 242276-250G | Make black Sylgard dishes |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | Dissect and mount fly brains |
| Micro slide | Corning | 2948-75×25 | Mount fly brains |
| Micro cover glass No.1.5 | VWR International | 48366-205 | Mount fly brains |
| Nail polish | Local vendor | not available | Seal micro cover glass on micro slides |
| Incubator | Kansin Instruments | LTI603 | culture flies at 25°C |
| (or other vendors) | |||
| Water bath | Kansin Instruments | WB212-B2 | Induce heat-shock in flies at 37°C |
| (or other vendors) | |||
| Orbital shaker | Kansin Instruments | OS701 | Wash and immunostain fly brains |
| (or other vendors) | |||
| Dissection microscope | Leica | EZ4 | Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains |
| Confocal microscope | Zeiss (or other vendors) | LSM 700 (or other models) | Image tsMARCM clones |
| image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser) |
Zeiss | not available | Project stacks of confocal images |
| image-processing software 2 (e.g., Image-J) |
not available | not available | Count cell number of tsMARCM clones |
References
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