Cell Lineage Analyser och genfunktion studier Använda Twin plats MARCM

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för en mosaik märkningsteknik som tillåter visualisering av neuron härledda från en gemensam ursprungscell i två distinkta färger. Detta underlättar neurala härstamning analys med möjlighet att födelsehållande enskilda nervceller och studera geners funktion i samma nervceller i olika individer.

Abstract

M osaic ANALYS med en r epressible c ell m Arker (MARCM) är en positiv mosaik märkningssystem som har i stor utsträckning i Drosophila neurobiologiska studier för att skildra intrikata morfologier och manipulera funktionen av gener i delmängder av nervceller inom annars omärkta och ostörda organismer. Genetiska mosaiker genereras i MARCM systemet förmedlas genom ställesspecifik rekombination mellan homologa kromosomer inom dividera föregångarceller för att producera både märkta (MARCM kloner) och omärkta dotterceller under mitos. En förlängning av MARCM metod, kallad twin-spot MARCM (tsMARCM), etiketter både av tvilling celler härledda från en gemensam stamfader med två distinkta färger. Denna teknik har utvecklats för att göra det möjligt för hämtning av nyttig information från både hemi-linjerna. Genom omfattande analys av olika par av tsMARCM kloner tillåter tsMARCM systemet högupplösta neurala härstamning Mapping för att avslöja den exakta födelseordning de märkta nervceller som produceras från vanliga stamceller. Dessutom tsMARCM systemet sträcker sig också genfunktion studier genom att tillåta fenotypisk analys av identiska nervceller av olika djur. Här beskriver vi hur man tillämpa tsMARCM systemet för att underlätta studier av neural utveckling i Drosophila.

Introduction

Hjärnan, består av ett stort antal och olika typer av nervceller, begåvar djur med förmåga att uppfatta, bearbeta och svara på utmaningarna från den yttre världen. Neuroner i den vuxna Drosophila centrala hjärnan är härledda från ett begränsat antal av neurala stamceller, som kallas neuroblaster (NBS), under utveckling ^{en, två.} De flesta av NBS deltar i hjärnan neurogenes i Drosophila genomgå asymmetrisk division att generera självförnyande NBs och ganglion moderceller (GMC), och GMC går sedan genom ytterligare en runda av division för att producera två dotterceller som differentierar till neuroner ³ (Figur 1A ). På grund av intrikat av neuronal morfologi och de utmaningar som är förknippade med att identifiera specifika nervceller, en positiv mosaik märkning teknik, mosaik analys med en undertryckcellmarkör (MARCM), uppfanns för att göra det möjligt för visualization av en enda neuron eller en liten delmängd av nervceller av befolkningen i omgivande, omärkta neuron ^4.

MARCM utnyttjar flippas (FLP) / FLP måligenkännande (FRT) system för att förmedla platsspecifik rekombination mellan homologa kromosomer inom en skiljeföregångare cell som bär en heterozygot allel av en repressorgen, vars uttryck normalt hämmar uttryck av en reportergen ^4. Efter den mitotiska delning, är de rekombinanta kromosomer segregeras till enkelceller, så att en cell innehåller homozygota alleler av repressor-genen och den andra cellen har ingen repressorgen-expressionen av reportern i den cellen (och dess ättlingar) är inte längre blockerad ^4. Tre klonala mönster finns vanligen i en MARCM experiment när FLP är stokastiskt induceras i NBs eller GMC: encelliga och två-cell-GMC-kloner, som skildrar neuronal morfologi vid encelliga Upplösning in, och flercelliga-NB-kloner, som avslöjar hela morfologiska mönster av neuron härledda från en gemensam NB (Figur 1B). Den MARCM teknik har i stor utsträckning i Drosophila neurobiologiska studier, bland annat i neuronal typbeteckning för att rekonstruera hjärnan hela kabelnätverk, analyser neurala härstamning för att avslöja utvecklingshistoria av nervceller, fenotypisk karakterisering av genfunktioner involverade i cell öde specifikation, och neuronal morfogenes och differentiering Studier ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Eftersom konventionell MARCM etiketter endast en av de två dotterceller (och härstamningar) efter den inducerade mitotiska rekombinationshändelsen, är potentiellt användbar information från den omärkta sidan förlorade. Denna begränsning hindrar tillämpningen av den grundläggande MARCM systemet till högupplösta analyser av många neurala linjer som byter cell öden i tempo eller precision analyser av genfunktioner i identiska neuroner i olika djur ^{11, 12.}

Twin plats MARCM (tsMARCM) är ett avancerat system som märker neuroner som härrör från en gemensam stamfader med två distinkta färger, vilket möjliggör återvinning av nyttig information från båda sidor av de två celler och därmed övervinna begränsningen av den ursprungliga MARCM systemet ¹¹ ( Figur 2A – 2C). I tsMARCM systemet två RNA-interferens (RNAi) baserade suppressorer ligger på trans-platser av homologa kromosomer inom en föregångare cell, och uttrycket av dessa suppressorer hämma självständigt uttryck för deras respektive reportrar (Figur 2B). Efter platsspecifik mitotiska rekombination förmedlad genom FLP / FRT-systemet, TWo RNAi-baserade suppressorer blivit segregerade till enkelceller för att tillåta uttrycket av distinkta reportrar (figur 2b). Två klonala mönster, encelliga samband med encelliga kloner och två-cell-GMC i samband med flercelliga-NB-kloner, typiskt sett i en tsMARCM experiment (figur 2C). Information som härrör från den ena sidan av de två cellerna kan användas som referens för den andra sidan, vilket möjliggör hög upplösning neurala härstamning analyser, såsom födelsehållande av märkta nervceller, och fenotypiska analyser av identiska nervceller i olika djur för exakt undersökning av nerv geners funktion ^{11, 12.} Här presenterar vi en steg-för-steg-protokollet beskriver hur man genomför en tsMARCM experiment, som kan användas av andra laboratorier för att bredda sina studier av neural utveckling (liksom utvecklingen av andra vävnader, i förekommande fall) i Drosophila.

Protocol

1. Bygg tsMARCM-ready Flugor Använda Obligatorisk Transgener 11, 13 Generera den ursprungliga versionen av tsMARCM-färdiga flugor från transgener som genomförs av enskilda flugor 11 (se tabell 1). Genomföra standardgylf genetiska korsningsscheman, som har beskrivits tidigare, genom att sätta multipla transgener i samma gylf lagren 13. I en föräldralinje, montera de trans…

Representative Results

Den tsMARCM Systemet har använts för att underlätta neurala härstamning analyser och genfunktion studier genom att hämta viktig information om nervceller som härrör från vanliga NBs. Systemet har använts för att identifiera de flesta (om inte alla) neuronala typer bestämma cellantalet av varje neuronal typ, och fastställa födelse beställning av dessa neuroner 11, 12, 18 (se <strong…

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Steg 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5, och 3.2 är kritiska för att erhålla goda tsMARCM resultat. Vävnadsspecifika -GAL4 förare som inte uttrycker GAL4 i neurala stamceller är att föredra för steg 1.1.1 och 1.2.1. Undvik över trängs djuren odlas i fly-mat flaskor i steg 2,3. Eftersom induktionen latens, expressionsnivån av FLP vid värmechock, och den genomsnittliga delningstiden av neurala progenitorceller (dvs., NBS och GMC) inte är kända, är …

Materials

Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75×25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones