تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا
Summary
الاتصالات بين الخلايا النباتية، plasmodesmata (Pd)، تلعب الأدوار المركزية في مصنع التفاعلات فسيولوجيا ومصنع للفيروسات. يتم فرز الحرجة للنقل Pd الإشارات التي توجه البروتينات للمشتريات. غير معرفتنا في تسلسل هذه لا تزال في مهدها. يصف لنا استراتيجية لتحديد إشارات التعريب Pd في البروتينات المستهدفة Pd.
Abstract
Plasmodesmata (Pd) هي خلية إلى الاتصالات التي تعمل كبوابات تنقل من خلالها الجزيئات الصغيرة والكبيرة بين الخلايا النباتية. بينما النقل Pd من جزيئات صغيرة، مثل الأيونات والماء، المفترض أن يحدث مكتوفي الأيدي، نقل خلية إلى خلية من الجزيئات البيولوجية الكبرى، مثل البروتينات، يحدث على الأرجح عبر إليه نشطة تتضمن إشارات محددة تستهدف في نقل جزيء. ندرة plasmodesmata التي تم تحديدها (Pd) ترجمة الإشارات (PLSs) قد مقيدة بشدة فهم الفرز البروتين مسارات تشارك في زرع خلية إلى خلية الجزيئات النقل والاتصالات. من ثروة النباتات البروتينات الذاتية والفيروسية المعروفة لحركة المرور من خلال Pd، PLSs ثلاثة فقط أبلغ حتى الآن، كل منهم من البروتينات النباتية الذاتية. وبالتالي، من المهم وضع استراتيجية تجريبية موثوقة ومنهجية لتحديد تسلسل الثابتة والمتنقلة فنية، التي ضرورية وكافية لاستهداف Pd، مباشرة في المعيشة الخلايا النباتية. هنا، يمكننا وصف واحد مثل هذه الاستراتيجية كنموذج باستخدام حركة الخلية للخلية البروتين (MP) فيروس تبرقش التبغ (TMV). هذه التجارب، التي حددت ووصفت الأول النباتية الثابتة والمتنقلة الفيروسية، ويمكن تكييفها لاكتشاف تسلسل الثابتة والمتنقلة في البروتينات الأكثر استهدافاً Pd.
Introduction
Plasmodesmata (Pd) تعمل كقنوات لنقل المنظمين مفتاح التنمية النباتية و morphogenesis، بدءاً من عوامل النسخ مرناً وجزيئات الحمض النووي الريبي صغيرة بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، تستخدم هذا قدرة النقل الجزيئات Pd معظم الفيروسات النباتية لانتشارها بين الخلايا أثناء العدوى؛ للانتقال عبر Pd، تطورت فيروسات النباتات البروتينات المتخصصة، ووصف حركة البروتينات (MPs)، التي تستهدف على وجه التحديد إلى Pd1،2،3،4،،من56 , 7-الجزيئية مسارات النقل Pd على الأرجح ترابطاً وثيقا مع تسلسل معين التي تستهدف نقل البروتينات في هذه المسارات. وهكذا، قد يكون تحديد هذه الإشارات التعريب Pd (PLSs) التشخيص لمسار النقل Pd المقابلة. وهذا قياسا ل النقل Pd8، على سبيل المثال، إلى مسارات مختلفة استيراد النووية، التي يمكن أن تكون محددة للتعريب النووية المختلفة إشارة (NLS) تسلسل9،10. من الناحية المفاهيمية، نلس و PLSs تمثل تسلسل استهداف سوبسيلولار غير كليفابل التي ضرورية وكافية لاستهداف. ولكن، خلافا نلس11، تسلسل المعلومات حول PLSs محدودة للغاية. على وجه التحديد، سجلت أربعة فقط تسلسل البروتين المتورطين في استهداف Pd، مع كل منهم المستمدة من البروتينات النباتية الذاتية. ويمثل أول واحد مجال هوميوبوكس KN112 – عامل نسخ الذي ينتقل من طبقات الخلايا الداخلية للبشرة من أوراق النبات13 – وبه نوكس هومولوجس14. أيضا هو ثانية واحدة من عامل نسخ، شعبة الشؤون المالية، التي تتضمن الثابتة والمتنقلة المفترضة وصفه الاتجار بين الخلايا (IT) عزر15. التسلسل الثالث من بروتين غشائي نوع plasmodesmata المقيم 1 PDLP1، ويتم تمثيله بواسطة مجال transmembrane16. وأخيراً، Pd الرابعة استهداف تسلسل أبلغ مؤخرا عن جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)-البروتينات المرتبطة، وأنه يمثل إشارة التعديل جليكوسيلفوسفاتيديلينوسيتول (GPI)17.
من المثير للاهتمام، وحتى وقت قريب جداً، لا PLSs أبلغ النواب الفيروسي. أشارت الدراسات السابقة إلى وجود تسلسل الثابتة والمتنقلة المفترضة في النبات الفيروسية MPs18،19، ولكن ليس صحيحاً الثابتة والمتنقلة، أيتسلسل الأحماض الأمينية الحد أدنى الضروري والكافي لاستهداف Pd (جزيء بضائع لا علاقة لها كل على سبيل المثال-، الحراجية المعتمدة) قد حددت في النائب فيروسية. بعد واحدة من هذه البروتينات، النائب من فيروس تبرقش التبغ (TMV)، كان الأول للمشتريات التي تم التعريب والنقل تبين20.
ولسد هذه الفجوة، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية لتحديد “تمف النائب الثابتة والمتنقلة”. استندت هذه الاستراتيجية على ثلاثة مفاهيم. (ط) وحددنا الثابتة والمتنقلة كتسلسل الحد أدنى من الأحماض الأمينية التي ضرورية وكافية لاستهداف البروتين إلى Pd21. (ثانيا) لأن النائب تمف يستهدف أولاً Pd وثم ترانسلوكاتيس من خلال هذه القنوات22، نحن تهدف إلى فصل هذين النشاطين والتعرف الثابتة والمتنقلة حسنة النية، التي تعمل فقط من أجل استهداف Pd، وليس للنقل اللاحقة. (ثالثا) قمنا بتحليل الثابتة والمتنقلة التي تم تحديدها للمخلفات من الأحماض الأمينية الهامة للمشتريات استهداف نشاط، سواء هيكلياً أو وظيفيا. باستخدام هذا النهج، نحن تحديد تسلسل بقايا الأحماض أمينية 50 في الأمينية المحطة “النائب تمف” بمثابة النية الثابتة والمتنقلة. وكان ذلك بإنتاج سلسلة من الشظايا “تمف النائب” أن مشبعة على طول من البروتين، ووضع علامات على الكربوكسيل تيرميني مع الحركة وعابر إذ تعرب عن لهم في الأنسجة النباتية. تعريب Pd كل أجزاء اختبار تحددها كوكسبريسينج لهم مع بروتين علامة Pd، PDCB1 (Pd كلوس ملزمة البروتين 1)23. واعتبر الجزء الأصغر التي لا تزال المترجمة إلى شعبة المشتريات، ولكن عدم اجتياز Pd، لتمثيل الثابتة والمتنقلة. وأخيراً، كان الثابتة والمتنقلة ألانين الممسوحة ضوئياً لتحديد بقايا الأحماض الأمينية الأساسية اللازمة لهيكل و/أو وظيفة.
بينما نحن هنا لتوضيح هذا النهج بوصف تحديد “تمف النائب الثابتة والمتنقلة”، فإنه يجوز لاكتشاف PLSs في أي البروتينات المستهدفة لشعبة المشتريات الأخرى، سواء ترميز بمسببات الأمراض النباتية أو النباتات أنفسهم؛ وهذا لأن لدينا أسلوب عدم الاستفادة من أي ميزات فريدة من نوعها الفيروسية من أعضاء البرلمان فيما يتعلق بقدرتهم على الهدف إلى Pd.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول له أربعة مكونات أساسية: مفهوم تحديد تسلسل ضروري وكاف لاستهداف Pd، تقسيم منهجي من بروتين الفائدة إلى الشظايا التي تنخفض تدريجيا في الطول، والصمامات تم اختبارها الشظايا إلى بروتين أوتوفلوريسسينت الذي يخدم كعلامة وشحن الجزيئات، والتحليل الوظيفي لاستهداف Pd في المعيشة زرع الأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لعدم وجود مساحة، استشهدنا الغالب استعراض المواد، ونعتذر لزملائنا واستشهد بعدم عملها الأصلي. العمل في مختبر لالح معتمد من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة، وجبهة الخلاص الوطني، ووزارة الزراعة/NIFA، بارد، وقوات حرس الحدود إلى الخامس، ومختبر S.G.L. معتمد من قبل المعهد الوطني للصحة والأموال من أقسام أمراض النبات والأحياء النباتية-ميكروب S.G.L.
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
References
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
- Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
