זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו
Summary
צמח חיבורי המערכת, plasmodesmata (Pd), ממלאים תפקידים מרכזי במפעל אינטראקציות פיזיולוגיה של הצמח-וירוס. קריטי להעביר Pd המיון מתבצע אותות ישיר חלבונים לתחנת משטרה. עם זאת, הידע שלנו על רצפי אלה הוא עדיין בחיתוליו. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות Pd אותות לוקליזציה בחלבונים Pd, ממוקדות.
Abstract
Plasmodesmata (Pd) הם חיבורים לתא לתפקד כשערי שדרכו מולקולות קטנות וגדולות מועברים בין תאי הצמח. ואילו משטרת התעבורה של מולקולות קטנות, כגון יונים, מים, יש להניח להתרחש באופן. פסיבי, תחבורה לתא של מקרומולקולות ביולוגיות, כגון חלבונים, קרוב לוודאי מתרחשת דרך מנגנון פעיל המערבת אותות מיקוד ספציפי על מועבר מולקולה. המחסור אותות לוקליזציה מזוהה plasmodesmata (Pd) (PLSs) הגבלות קשות על ההבנה של מיון חלבונים המעורבים בצמח-לתא macromolecular תחבורה ותקשורת. מתוך שפע של הצמח חלבונים אנדוגני וויראליים ידועים תעבורה דרך Pd, PLSs רק שלושה דווחו עד היום, כולם בעלי פרוטאינים צמחיים אנדוגני. לכן, חשוב לפתח אסטרטגיה שיטתית ואמין ניסיוני לזהות את רצף PLS פונקציונלי, הוא הצורך וגם מספיק עבור מיקוד Pd, ישירות בסלון לשתול תאים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה אחת כזו באמצעות כמו פרדיגמה החלבון-לתא התנועה (MP) של נגיף פסיפס הטבק (TMV). ניסויים אלו, מזוהה, מאופיין הראשון לשתול PLS ויראלי, ניתן להתאים עבור גילוי PLS רצפי חלבונים ביותר, ממוקדות Pd.
Introduction
הפונקציה plasmodesmata (Pd) כערוצים עבור תעבורה המערכת של הרגולטורים מפתח של התפתחות הצמח, מורפוגנזה, ועד גורמי שעתוק mRNA של מולקולות RNA קטנות. יתר על כן, יכולתו macromolecular התחבורה של המשטרה הוא מנוצל על ידי מרבית הווירוסים צמח על התפשטות המערכת שלהם במהלך זיהום; כדי לעבור בין Pd, וירוסים התפתחו חלבונים מיוחדים, כינה את התנועה חלבונים (MPs), שמתמקדים Pd1,2,3,4,5,6 , 7. מסלולים מולקולריים התחבורה Pd רוב הסיכויים הם מחוברים בצורה אינטימית עם הרצפים ספציפי שמכוון את החלבונים מועבר לתוך המסלולים הללו. לפיכך, זיהוי אותות לוקליזציה אלה Pd (PLSs) ייתכן אבחון של מסלול התחבורה Pd המתאימים. זאת על ידי השוואה של משטרת התעבורה8, לדוגמה, מסלולים שונים ייבוא גרעינית, אשר יכול להיות ספציפיות עבור שונה לוקליזציה גרעיני אות (שקל) רצפים9,10. מבחינה מושגית, הן NLSs והן PLSs מייצגים רצפים מיקוד subcellular-cleavable הכרחי ובלתי מספיק עבור מיקוד. אולם, בניגוד NLSs11, המידע רצף על PLSs היא מוגבלות מאוד. באופן ספציפי, רק ארבעה רצפים חלבון מעורב Pd מיקוד דווחו, עם כולן נגזר פרוטאינים צמחיים אנדוגני. הראשון מיוצג על ידי תחום גנים homeobox של KN112 – גורם שעתוק שזז משכבות התא הפנימי כדי אפידרמיס של עלה צמח13 – ו שלו homologs נוקס14. . השני גם הוא מפקטור שעתוק, Dof, אשר מכיל PLS בשם תיאר את הסחר המערכת (IT) מוטיב15. הרצף השלישי של החלבון ממברנה PDLP1 plasmodesmata תושב סוג 1, הוא מיוצג על ידי תחום transmembrane16. לבסוף, המשטרה הרביעי מיקוד רצף דווח לאחרונה על glycosylphosphatidylinositol (GPI)-חלבונים מעוגן וזה מיוצג על ידי האות השינוי17glycosylphosphatidylinositol (GPI).
מעניין, עד ממש לאחרונה, דווחו PLSs אין עבור MPs ויראלי. מחקרים קודמים מצביעות על הימצאות בשם רצפים PLS צמח-18,MPs-ויראלי-19, אך אין PLS אמיתי, דהיינו, רצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי והן מספיקות עבור משטרת פילוח של (מולקולה מטענים לא קשורים למשל., CFP) זוהתה ב MP נגיפי. עוד אחד החלבונים האלה, MP של נגיף פסיפס הטבק (TMV), היה הראשון אשר Pd לוקליזציה ותעבורה כבר הפגינו20.
כדי לטפל פער זה, פיתחנו אסטרטגיית ניסיוני לזהות TMV MP PLS. אסטרטגיה זו התבססה על שלושה מושגים. (i) אנחנו מוגדרים PLS כרצף חומצת אמינו מינימלי הכרחי ולא מספיק חלבון המיקוד Pd21. (ii) כי TMV MP תחילה מטרות Pd, ואז translocates דרך ערוצים אלה22, אנחנו מכוונים uncoupling שתי פעילויות וזיהוי ביסקוויטים בתום לב, אשר מתפקד רק עבור משטרת מיקוד, ולא על הטרנספורט עוקבות. (iii). ניתחנו ביסקוויטים מזוהה עבור שאריות חומצה אמינית חשובה עבור שלה Pd מיקוד פעילות, בין אם מבחינה מבנית או פונקציונלית. באמצעות גישה זו, מאפשרת לנו רצף שאריות חומצה אמינו 50 התחנה הסופית-אמינו של MP TMV שפועל PLS בתום-לב. זה נעשה על ידי הפקת סדרת שברי TMV MP כי רווי לכל אורכה של החלבון, תיוג שלהם carboxyl-termini עם CFP transiently לבטא אותם ברקמות הצמח. משטרת לוקליזציה של כל אחד מהשברים שנבדקו נקבע על-ידי coexpressing אותם עם משטרת סמן חלבון, PDCB1 (משטרת callose מחייב חלבון 1)23. השבר הקטן עדיין מקומי לתחנת משטרה, אך לא לחצות Pd, נחשב לייצוג PLS. לבסוף, ביסקוויטים היה אלנין-סריקה כדי לקבוע את שאריות מפתח חומצת אמינו הדרושות עבור מבנה ו/או הפונקציה שלה.
ואילו כאן אנחנו להמחיש את גישה זו על-ידי תיאור זיהוי של MP TMV PLS, זה עשוי להיות מועסק לגלות PLSs בחלבונים כל אחרים, ממוקדות Pd, אם מקודד על ידי פתוגנים צמח או את הצמחים עצמם; זה בגלל השיטה שלנו לא לנצל את כל תכונות ייחודיות של MPs ויראלי לגבי יכולתם היעד לתחנת משטרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה יש ארבעה מרכיבי הליבה: הרעיון של זיהוי רצף הוא נחוץ וגם מספיק עבור מיקוד לתחנת משטרה, חטיבת שיטתית של החלבון עניין לחלקים שגודלם מצטמצם בהדרגה אורך, פיוזינג נבדק קטעים לחלבון autofluorescent המשמשת כתג והן מטען macromolecular, וכן assay פונקציונלי עבור משטרת פילוח חיים צמח רקמות בעקבות הביטוי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
על חוסר מקום, בקידושין שהבאנו בעיקר סקירת מאמרים, אנו מתנצלים לעמיתים שלנו שעבודתם המקורי לא צוטט. העבודה במעבדה וייטקונג נתמך על ידי מענקים NIH, ה-NSF, משרד החקלאות/NIFA, ברד, BSF וייטקונג, המעבדה S.G.L. נתמך על ידי NIH כספים מן המחלקות של פתולוגיה ביולוגיה צמח-חיידק S.G.L.
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
References
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
- Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
