Identificação de sequências de localização Plasmodesmal em proteínas em Planta
Summary
Planta de conexões intercelulares, os dictiossomos (Pd), desempenham um papel central na planta de interações planta-vírus e fisiologia. Crítica para o transporte de Pd está classificando os sinais que dirigem proteínas à polícia. No entanto, nosso conhecimento sobre estas sequências é ainda em sua infância. Nós descrevemos uma estratégia para identificar sinais de localização de Pd em proteínas Pd-alvo.
Abstract
Dictiossomos (Pd) são ligações de celular para celular que funcionam como gateways através do qual moléculas pequenas e grandes são transportadas entre células vegetais. Considerando que o transporte de Pd de pequenas moléculas, como íons e água, presume-se ocorrer passivamente, célula a célula transporte de macromoléculas biológicas, tais proteínas, provavelmente ocorre através de um mecanismo ativo que envolve os sinais de direcionamentos específicos sobre o molécula transportada. A escassez de sinais de localização de dictiossomos identificados (Pd) (PLSs) restringiu severamente o entendimento de proteína-classificação vias envolvidas na planta transporte macromolecular de célula para célula e comunicação. De uma riqueza de planta endógenas e virais proteínas conhecidas para o tráfego por meio de Pd, PLSs apenas três foram relatados até à data, todos eles de proteínas vegetais endógenos. Assim, é importante desenvolver uma estratégia experimental sistemática e confiável para identificar uma sequência PLS funcional, que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, diretamente no vivo células vegetais. Aqui, descrevemos uma tal estratégia usando como um paradigma da proteína de célula para célula de movimento (MP) do vírus do mosaico do tabaco (TMV). Estas experiências, que identificaram e caracterizam a primeira planta PLS viral, pode ser adaptadas para descoberta de PLS sequências em proteínas mais Pd-alvo.
Introduction
Dictiossomos (Pd) funcionam como condutos para transporte intercelular dos reguladores chaves do desenvolvimento da planta e morfogênese, variando de fatores de transcrição de mRNA e pequenas moléculas de RNA. Além disso, esta capacidade de transporte macromolecular da DP é utilizada pela maioria dos vírus de planta para sua propagação intercelular durante a infecção; para mover-se através de Pd, vírus de plantas evoluíram proteínas especializadas, denominadas proteínas de movimento (MPs), que visam especificamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vias moleculares de transporte Pd provavelmente estão intimamente interligadas com as sequências específicas que visam as proteínas transportadas para essas vias. Assim, a identificação destes sinais de localização do Pd (PLSs) pode ser diagnóstica da via de transporte correspondente do Pd. Isto é por analogia de Pd transporte8, por exemplo, a importação nuclear diferentes vias, que podem ser específicas para diferentes localização nuclear (NLS) de sinal sequências9,10. Conceitualmente, tanto NLSs e PLSs representam não-cleavable subcellular direcionamentos sequências que são necessárias e suficientes para o direcionamento. No entanto, ao contrário de NLSs11, as informações de sequência sobre PLSs são severamente limitadas. Especificamente, somente quatro sequências de proteínas envolvidas no direcionamento de Pd têm sido relatadas, com todos eles derivados de proteínas vegetais endógenos. O primeiro deles é representado por um domínio homeobox KN112 – um factor de transcrição que se move de camadas celulares interna a epiderme da planta folha13 – e sua KNOX homologs14. O segundo também é de um fator de transcrição, Dof, que contém um putativo PLS descrito como o tráfico intercelular (IT) motivo15. A terceira sequência é da proteína de membrana PDLP1 residente dictiossomos tipo 1, e é representado por um domínio transmembrana16. Finalmente, o quarto Pd segmentação sequência foi relatado recentemente para glicosilfostidilinosiol (GPI)-proteínas ancoradas e é representado por glicosilfostidilinosiol (GPI) modificação sinal17.
Curiosamente, até muito recentemente, nenhum PLSs têm sido relatados para MPs virais. Estudos anteriores indicaram a presença de sequências de PLS putativos em planta viral MPs18,19, mas não PLS verdadeiro, ou seja, uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o Pd direcionamento de uma carga independentes molécula ( ex., PCP) foi identificada em um MP viral. Ainda uma destas proteínas, MP do vírus do mosaico do tabaco (TMV), foi o primeiro para que a polícia de localização e transporte tem sido demonstrada20.
Para resolver esta lacuna, desenvolvemos uma estratégia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estratégia foi baseada em três conceitos. (i) definimos PLS como uma sequência de aminoácidos mínima necessária e suficiente para o direcionamento de proteína para Pd21. (ii) porque TMV MP visa primeiro Pd e translocates então através destes canais,22, que visa desatrelar essas duas atividades e identificando o PLS bona fide, que funciona apenas para o direcionamento de Pd e não para o transporte subsequente. (iii) foram analisados o PLS identificado por resíduos de aminoácidos importantes para a sua polícia visando a atividade, seja estrutural ou funcionalmente. Usando essa abordagem, nós delineado uma sequência de 50 amino ácido resíduos no amino-terminal do TMV MP que atua como PLS bona fide. Isto foi feito por produzir uma série de fragmentos de TMV MP que saturado de todo o comprimento da proteína, etiquetando seus carboxila-termini com PCP e transitoriamente expressá-los em tecidos vegetais. Localização de PD de cada um dos fragmentos testados foi determinada por coexpressing-los com uma proteína de marcador de Pd, PDCB1 (Pd callose proteína 1)23. O fragmento menor que ainda localizada, Pd, mas não atravessar Pd, considerou-se para representar o PLS. Finalmente, o PLS era alanina-digitalizadas para determinar os resíduos de aminoácidos chave necessários para sua estrutura e/ou função.
Considerando que aqui ilustramos esta abordagem descrevendo a identificação de TMV MP PLS, podem ser empregada para descobrir PLSs em qualquer outras proteínas Pd-alvo, se codificado por patógenos vegetais ou pelas plantas Isso ocorre porque nosso método não leva vantagem de quaisquer características únicas de MPs virais com relação à sua capacidade de alvo para Pd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo tem quatro componentes principais: o conceito de identificar uma sequência que é necessário e suficiente para o direcionamento de Pd, divisão sistemática da proteína de interesse em fragmentos que são progressivamente reduzidos em comprimento, fundindo o testado fragmentos de uma proteína autofluorescent que serve como marca e como carga macromolecular e ensaio funcional para Pd direcionamento na vida da planta tecidos seguindo a expressão transiente das proteínas de fusão testado. Observe que a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A falta de espaço, nós citados principalmente artigos de revisão, e pedimos desculpas aos nossos colegas, cuja obra original não foi citada. O trabalho no laboratório V.C. é suportado por concessões do NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD e BSF para V.C., e o laboratório S.G.L. é suportado pelo NIH e fundos do departamentos de Fitopatologia e biologia vegetal-micróbio para S.G.L.
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
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