JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Identifiering av Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Published: August 15, 2017
doi:
10.3791/55301
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology,Cornell University

Summary

Plantera intercellulära anslutningar, plasmodesmata (Pd), spelar centrala roller i växt fysiologi och växt-virus interaktioner. Kritisk till Pd transporter sorterar signaler att direkt proteiner till Pd. Vår kunskap om dessa sekvenser är dock fortfarande i sin linda. Vi beskriver en strategi för att identifiera Pd lokalisering signaler i Pd-riktade proteiner.

Abstract

Plasmodesmata (Pd) är cell-till-cell anslutningar som fungerar som gateways genom vilka små och stora molekyler transporteras mellan växtcellerna. Pd transport av små molekyler, som joner och vatten, antas uppstå passivt, cell-till-cell transport av biologiska makromolekyler, sådana proteiner, troligen sker via en aktiv mekanism som innebär särskilda inriktning signaler på den transporterade molekylen. Bristen på identifierade plasmodesmata (Pd) lokalisering signaler (PLSs) har stränga förståelsen av protein-sortering inblandade i plant cell till cell makromolekylär transport och kommunikation. Från en mängd växt endogena och virala proteiner kända trafik genom Pd, endast tre PLSs har rapporterats hittills, alla av dem från endogena vegetabiliska proteiner. Det är därför viktigt att utveckla en tillförlitlig och systematisk experimentell strategi för att identifiera en funktionell PLS sekvens, som är både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning, direkt i levande växtceller. Här beskriver vi en sådan strategi använder som ett paradigm proteinet cell till cell rörelse (MP) av tobak mosaic virus (TMV). Dessa experiment, som identifieras och karakteriseras först växt viral PLS, kan anpassas för upptäckten av PLS sekvenser i mest Pd-riktade proteiner.

Introduction

Plasmodesmata (Pd) fungerar som transitländer för intercellulära transport av viktiga regulatorer av anläggningar utveckling och morfogenes, alltifrån transkriptionsfaktorer till mRNA och små RNA-molekyler. Dessutom utnyttjas detta makromolekylära transportkapaciteten hos Pd av de flesta växt virus för de intercellulära sprids under infektion; Om du vill flytta genom Pd, har plant virus utvecklats specialiserade proteiner, så kallade rörelse proteiner (MPs), som specifikt riktar sig till Pd1,2,3,4,5,6 , 7. molekylära vägar av Pd transporter troligtvis är intimt sammankopplade med de specifika sekvenser som riktar de transporterna proteinerna i dessa vägar. Identifiering av dessa Pd lokalisering signaler (PLSs) kan således vara diagnostiska av motsvarande Pd transport väg. Detta är analogt Pd transport8, till exempel att olika nukleära importera vägar, som kan vara specifika för olika cellkärnelokalisering signal (NLS) sekvenser9,10. Begreppsmässigt, representerar både NLSs och PLSs icke-cleavable subcellulär inriktning sekvenser som är nödvändig och tillräcklig för inriktning. Men till skillnad från NLSs11är sekvensinformation om PLSs starkt begränsad. Specifikt, har endast fyra proteinsekvenser som är inblandade i Pd inriktning rapporterats, alla av dem härrör från endogena vegetabiliska proteiner. Den första som representeras av en homeobox domän KN112 – en transkriptionsfaktor som flyttar från inre celllagrar till epidermis av växt blad13 – och dess KNOX homologs14. Den andra också är från en transkriptionsfaktor, Dof, som innehåller en förmodad PLS beskrivs som intercellulära människohandel (IT) motiv15. Den tredje sekvensen är från den PDLP1 plasmodesmata-resident typ 1 membranprotein, och är representerad med en transmembrana domän16. Slutligen, den fjärde Pd inriktning sekvens var nyligen rapporterat för glycosylphosphatidylinositol (GPI)-förankrade proteiner och det representeras av den glycosylphosphatidylinositol (GPI) modifiering signal17.

Tills helt nyligen, intressant, ingen PLSs rapporterats för viral MPs. Tidigare studier anges förekomsten av förmodad PLS sekvenser i växten viral MPs18,19, men ingen sann PLS, dvsen minimal aminosyrasekvens både nödvändig och tillräcklig för Pd inriktning av en icke-närstående Last molekyl ( t.ex., CFP) har upptäckts i en viral MP. Ännu var ett av dessa proteiner, MP av tobak mosaic virus (TMV), den första som Pd lokalisering och transport har varit påvisade20.

För att lösa denna lucka, utvecklade vi en experimentell strategi för att identifiera TMV MP PLS. Denna strategi baserades på tre begrepp. (i) vi definieras en minimal aminosyrasekvens som är både nödvändig och tillräcklig för proteinsekretion till Pd21PLS. (ii) eftersom TMV MP första mål Pd och sedan translocates genom dessa kanaler22, som vi syftar uncoupling dessa två aktiviteter och identifiera de bona fide PLS, som fungerar endast för Pd inriktning, och inte för efterföljande transport. (iii) Vi analyserade de identifierade PLS aminosyra restsubstanser viktigt för dess Pd inriktning aktivitet, oavsett om strukturellt eller funktionellt. Använder denna metod, avgränsad vi en 50-amino acid rester sekvens på amino-terminus av TMV MP som fungerar som bona fide PLS. Detta gjordes genom att producera en serie TMV MP fragment som mättade hela längden av proteinet, tagga deras karboxylgrupp-termini med GFP och övergående uttrycker dem i växt vävnader. PD lokalisering av var och en av de testa fragmenten bestämdes coexpressing dem med ett Pd markör protein, PDCB1 (Pd callose bindande protein 1)23. Den minsta fragment som fortfarande är lokaliserad till Pd, men inte färdas Pd, ansågs representera PLS. Slutligen var PLS alanin-skannade att fastställa de viktigaste aminosyra restsubstanser krävs för dess struktur eller funktion.

Medan här vi illustrera detta synsätt genom att beskriva identifiering av TMV MP PLS, kan det vara anställda att upptäcka PLSs i några andra Pd-riktade proteiner, oavsett om kodade av växten patogener eller växterna själva; Detta beror på att vår metod inte drar fördel av alla unika funktioner av viral MPs med avseende på deras förmåga att målet att Pd.

Protocol

1. växtmaterial Val av växtarter Använd växtarterna som är infödda till proteinet av intresse, dvs, en som kodar detta protein för endogena proteiner eller som representerar de naturliga värdarna för patogen för virala proteiner. Dessutom måste den utvalda växtart vara mottagliga för den valda metoden för övergående genetisk transformation.Obs: Studierna rutinmässigt anställa Nicotiana benthamiana, som föreställer en god värd för TMV och omvandlas effektivt …

Representative Results

De representativa uppgifter, som troget illustrera förväntade från protokollen beskrivs resultat och identifiera den TMV MP PLS, är anpassade från Yuan et al. 21. figur 1A summerar första stora konstruktioner uttrycker fullängds TMV MP (1-268), TMV MP PLS (som omfattar de första 50 aminosyra resterna av proteinet, 1-50), och dess alanin skanning V4A derivat smält till GFP (genereras som beskrivs i steg 2.2, 5.2 och 6) medan <stron…

Discussion

Detta protokoll har fyra grundläggande beståndsdelar: begreppet att identifiera en sekvens som är både nödvändig och tillräcklig för inriktning till Pd, systematisk uppdelning av proteinet av intresse i fragment som successivt minskar i längd, fusing de testade fragmenten till ett autofluorescent protein som fungerar både som taggen och makromolekylär last och funktionella test för Pd inriktning i levande växt vävnader efter övergående uttryck för testade fusionsproteinerna. Observera att Agrobacterium-m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

För brist på utrymme, vi citerade mestadels översiktsartiklar och vi ber om ursäkt till våra kolleger vars ursprungliga arbetet inte nämndes. Arbetet i V.C. laboratoriet stöds genom bidrag från NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD och BSF till V.C. och S.G.L. laboratoriet stöds av NIH och medel från avdelningar i växtpatologi och växt-mikrob biologi till S.G.L.

Materials

Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

Tags

Keywords: PlasmodesmataLocalization SignalIntercellular TransportProtein TargetingNicotiana BenthamianaFluorescent TaggingAgrobacterium TumefaciensTransient Expression
check_url/55301?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image