Planta में प्रोटीन में Plasmodesmal स्थानीयकरण अनुक्रम की पहचान
Summary
संयंत्र सेलुलर कनेक्शन, plasmodesmata (पीडी), संयंत्र शरीर क्रिया विज्ञान और संयंत्र-वायरस बातचीत में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं । पीडी परिवहन के लिए महत्वपूर्ण संकेत है कि पीडी के लिए सीधे प्रोटीन छंटाई कर रहे हैं । हालांकि, इन दृश्यों के बारे में हमारी जानकारी अभी भी अपनी प्रारंभिक अवस्था में है । हम पीडी-लक्षित प्रोटीन में पीडी स्थानीयकरण संकेतों की पहचान करने के लिए एक रणनीति का वर्णन.
Abstract
Plasmodesmata (पीडी) कक्ष के लिए सेल कनेक्शन है कि गेटवे के माध्यम से जो छोटे और बड़े अणुओं संयंत्र कोशिकाओं के बीच पहुंचाया जाता है के रूप में कार्य कर रहे हैं । ऐसे आयनों और पानी के रूप में छोटे अणुओं के पीडी परिवहन जबकि, निष्क्रिय होने के लिए माना है, कोशिका से कोशिका परिवहन जैविक अणुओं की, ऐसे प्रोटीन, सबसे अधिक संभावना एक सक्रिय तंत्र है कि पर विशिष्ट लक्ष्यीकरण संकेतों शामिल है के माध्यम से होता है उत्पात अणु. पहचान plasmodesmata (पीडी) स्थानीयकरण संकेतों (PLSs) की किल्लत गंभीर रूप से संयंत्र सेल-टू-सेल macromolecular परिवहन और संचार में शामिल प्रोटीन छँटाई रास्ते की समझ को प्रतिबंधित किया है । पीडी के माध्यम से यातायात के लिए जाना जाता संयंत्र अंतर्जात और वायरल प्रोटीन के एक धन से, केवल तीन PLSs तिथि करने के लिए सूचित किया गया है, उन सभी अंतर्जात संयंत्र प्रोटीन से । इस प्रकार, यह एक कार्यात्मक PLS अनुक्रम की पहचान करने के लिए एक विश्वसनीय और व्यवस्थित प्रयोगात्मक रणनीति विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है, कि दोनों आवश्यक है और पीडी लक्ष्यीकरण के लिए पर्याप्त है, सीधे रहने वाले संयंत्र कोशिकाओं में. यहां, हम एक ऐसी रणनीति का वर्णन एक प्रतिमान सेल के रूप में उपयोग करने वाली सेल आंदोलन प्रोटीन (सांसद) के तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) । इन प्रयोगों, कि पहचान और पहली संयंत्र वायरल pls विशेषता, सबसे पीडी-लक्षित प्रोटीन में PLS दृश्यों की खोज के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Introduction
Plasmodesmata (पीडी) संयंत्र विकास और morphogenesis के प्रमुख नियामकों के सेलुलर परिवहन के लिए नाली के रूप में कार्य, प्रतिलेखन कारकों से mRNA और छोटे आरएनए अणुओं को लेकर. इसके अलावा, पीडी के इस macromolecular परिवहन क्षमता संक्रमण के दौरान उनके सेलुलर प्रसार के लिए सबसे संयंत्र वायरस द्वारा उपयोग किया जाता है; पीडी के माध्यम से स्थानांतरित करने के लिए, संयंत्र वायरस विशेष प्रोटीन विकसित किया है, आंदोलन प्रोटीन (सांसदों), कि विशेष रूप से पीडी को लक्ष्य1,2,3,4,5,6 , 7. पीडी परिवहन के आण्विक रास्ते सबसे अधिक संभावना परिचित विशिष्ट अनुक्रम है कि इन रास्ते में परिवहन प्रोटीन लक्ष्य के साथ जुड़े हुए हैं । इस प्रकार, इन पीडी स्थानीयकरण संकेतों की पहचान (PLSs) इसी पीडी परिवहन मार्ग का निदान हो सकता है. यह पीडी परिवहन8के सादृश्य से है, उदाहरण के लिए, विभिन्न परमाणु आयात रास्ते, जो अलग परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) अनुक्रम9,10के लिए विशिष्ट किया जा सकता है । वैचारिक रूप से, NLSs और PLSs, दोनों ही लक्ष्यीकरण के लिए आवश्यक और पर्याप्त गैर-सट उपसेलुलर लक्ष्यीकरण अनुक्रम दर्शाते हैं. हालांकि, NLSs11के विपरीत, PLSs के बारे में अनुक्रम जानकारी गंभीर रूप से सीमित है । विशेष रूप से, पीडी लक्ष्यीकरण में शामिल केवल चार प्रोटीन अनुक्रम रिपोर्ट किया गया है, उन सभी के साथ अंतर्जात संयंत्र प्रोटीन से व्युत्पंन । पहले एक KN112 के एक homeobox डोमेन द्वारा प्रतिनिधित्व किया है-एक प्रतिलेखन कारक है कि भीतरी कोशिका परतों से संयंत्र पत्ती13 के एपिडर्मिस के लिए चलता है-और उसके KNOX homologs14। दूसरा एक भी एक प्रतिलेखन कारक है, Dof, जो एक ख्यात के रूप में वर्णित है PLS से है सेलुलर तस्करी (यह) आकृति15। तीसरा अनुक्रम PDLP1 plasmodesmata-निवासी प्रकार 1 झिल्ली प्रोटीन से है, और यह एक transmembrane डोमेन16द्वारा प्रतिनिधित्व किया है । अंत में, चौथे पीडी लक्ष्यीकरण अनुक्रम हाल ही में glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई)-लंगर प्रोटीन के लिए रिपोर्ट किया गया था और यह glycosylphosphatidylinositol (जीपीआई) संशोधन संकेत17द्वारा प्रतिनिधित्व है ।
दिलचस्प है, जब तक बहुत हाल ही में, कोई PLSs वायरल सांसदों के लिए सूचित किया गया है । पिछले अध्ययन संयंत्र वायरल सांसद18,19में ख्यात PLS दृश्यों की उपस्थिति का संकेत दिया है, लेकिन कोई सच PLS, यानी, एक ंयूनतम एमिनो एसिड अनुक्रम दोनों आवश्यक और एक असंबंधित कार्गो अणु के पीडी लक्ष्यीकरण के लिए पर्याप्त ( उदाहरणके लिए, एक वायरल सांसद की पहचान की गई है । अभी तक इन प्रोटीनों में से एक, तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV) के सांसद, सबसे पहले के लिए पीडी स्थानीयकरण और परिवहन20प्रदर्शन किया गया है ।
इस अंतर को संबोधित करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक रणनीति TMV सांसद PLS की पहचान विकसित की है । यह रणनीति तीन अवधारणाओं पर आधारित थी । (i) हम एक ंयूनतम एमिनो एसिड अनुक्रम है कि दोनों आवश्यक है और पर्याप्त है पीडी21को लक्षित प्रोटीन के लिए के रूप में PLS परिभाषित । (ii) क्योंकि TMV MP पहले पीडी को टारगेट करता है और फिर इन22चैनलों के माध्यम से translocates, हम इन दो गतिविधियों को युग्मित करने के उद्देश्य से और सदाशई की पहचान PLS, जो केवल पीडी लक्ष्यीकरण के लिए कार्य करता है, और बाद में परिवहन के लिए नहीं. (iii) हम अपने पीडी लक्ष्यीकरण गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण एमिनो एसिड अवशेषों के लिए पहचान PLS का विश्लेषण, चाहे संरचनात्मक या कार्यात्मक । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम delineated एक ५० अमीनो एसिड अवशेष अनुक्रम में एमिनो-TMV सांसद के टर्मिनस कि सदाशई के रूप में कार्य करता है PLS । यह TMV सांसद टुकड़े की एक श्रृंखला है कि प्रोटीन की पूरी लंबाई संतृप्त द्वारा किया गया था, उनके carboxyl-टर्मिनी के साथ टैगिंग और क्षणिक उंहें संयंत्र के ऊतकों में व्यक्त । प्रत्येक परीक्षण अंशों के पीडी स्थानीयकरण उन्हें एक पीडी मार्कर प्रोटीन के साथ coexpressing द्वारा निर्धारित किया गया था, PDCB1 (पीडी callose बाइंडिंग प्रोटीन 1)23. सबसे छोटा टुकड़ा अभी भी पीडी के लिए स्थानीयकृत, लेकिन पीडी पार नहीं किया, PLS का प्रतिनिधित्व करने के लिए माना जाता था. अंत में, PLS alanine था-कुंजी एमिनो एसिड अपनी संरचना और/या समारोह के लिए आवश्यक अवशेषों का निर्धारण करने के लिए स्कैन ।
यहां हम TMV सांसद PLS की पहचान का वर्णन करके इस दृष्टिकोण उदाहरण देकर स्पष्ट करना, यह किसी भी अंय पीडी में PLSs की खोज के लिए नियोजित किया जा सकता है प्रोटीन लक्षित, कि संयंत्र रोगजनकों द्वारा या पौधों को खुद द्वारा इनकोडिंग; इसका कारण यह है कि हमारी विधि के साथ वायरल सांसदों के किसी भी अनूठी विशेषताओं का लाभ नहीं ले पीडी को लक्ष्य करने के लिए उनकी क्षमता के संबंध है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल चार मुख्य घटक है: एक अनुक्रम है कि दोनों आवश्यक है और पीडी को लक्षित करने के लिए पर्याप्त है, जो उत्तरोत्तर लंबाई में कम कर रहे है कि टुकड़ों में ब्याज की प्रोटीन की व्यवस्थित विभाजन की पहचा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अंतरिक्ष की कमी के लिए, हम ज्यादातर समीक्षा लेख उद्धृत, और हम अपने सहयोगियों के लिए माफी मांगता हूं जिसका मूल काम उद्धृत नहीं किया गया । विद्याचरण प्रयोगशाला में काम NIH, NSF, USDA/निफा, भाट, और बीएसएफ से विद्याचरण के लिए अनुदान द्वारा समर्थित है, और S.G.L. प्रयोगशाला NIH और संयंत्र विकृति विज्ञान और संयंत्र के विभागों से धन का समर्थन किया है-सूक्ष्म जीवविज्ञान S.G.L. के लिए
Materials
| Confocal laser scanning microscope (CLSM) | Zeiss | LSM5 | Any CLSM with similar capabilities is appropriate |
| Zen software for confocal microscope imaging | Zeiss | 2009 version | The software should be compatible with the CLSM used |
| Quickchange II site-directed mutagenesis kit | Agilent | 200523 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| MES | Sigma-Aldrich | 69892 | |
| Syringes without needles | BD | 309659 | |
| MgCl2 | FisherScientific | M33-500 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 |
References
- Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
- Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
- Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
- Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
- Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
- Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
- Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
- Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
- Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
- Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
- Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
- Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
- Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
- Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
- Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
- Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
- Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
- Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
- Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
- Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
- Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
- Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
- Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
- Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
- Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
- Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
- Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
- Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
- Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
- Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
- Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
- Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
- Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
- Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
- Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
- Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
- Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
- Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
- Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
- Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
- Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
- Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
- Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
- Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
- Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
- Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
- Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).
