זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה
Summary
מאמר זה מתאר את זיהוי של חלבוני קושרי קרח מצמחי הקפאה-סובלנית דרך ההערכה של פעילות עיכוב-recrystallization הקרח והבידוד הבא של IBPs המקורית באמצעות טיהור זיקה-קרח.
Abstract
קרח מחייב חלבונים (IBPs) שייכים למשפחה של חלבונים-induced להדגיש כי מסונתזים על ידי אורגניזמים מסוימים חשופים לטמפרטורות שמתחת לאפס. בצמחים, ניזק הקפאה מתרחש כאשר גבישי קרח תאיים לגדול, וכתוצאה מכך פקיעת קרומי פלזמת תהליכי מוות תאי אפשרי. ספיחה של IBPs כדי גבישי קרח מגביל צמיחה נוספת על ידי תהליך המכונה עיכוב-recrystallization קרח (IRI), ובכך להפחית נזק הסלולר. IBPs גם להפגין את היכולת לדכא את נקודת הקיפאון של פתרון מתחת לנקודת היתוך שיווי משקל, בנכס הידוע היסטרזיס תרמית פעילות (TH). מאפייני הגנה אלו העלו עניין הזיהוי של IBPs הרומן עקב השימוש הפוטנציאלי שלהם ביישומים תעשייתיים, רפואיים וחקלאיים. מאמר זה מתאר את הזיהוי של הצמח IBPs דרך 1) והאימון החילוץ של IBPs ברקמת הצמח, 2) הקרנת תמציות לפעילות IRI, ו 3) בידוד purification של IBPs. בדומה להשפעת IBPs ידי חשיפה לטמפרטורה נמוכה, תמציות נבדקות לפעילות IRI באמצעות "assay מעיכה", המאפשר התצפית של צמיחת קריסטל קרח באמצעות מיקרוסקופ אור רגילה. assay זה דורש ריכוז חלבון נמוך ומייצר לתוצאות המתקבלות במהירות לפרש בקלות, מתן מסך ראשוני לפעילות מחייב קרח. IBPs ניתן לבודד אז את זיהום חלבונים על ידי ניצול רכושם של IBPs לספוג לקרח, באמצעות טכניקה הנקראת "טיהור קרח-זיקה". באמצעות lysates תא שנאסף תמציות צמח, חצי כדור ארץ קרח ניתן לגדל לאט על בדיקה פליז. זו משלבת IBPs לתוך המבנה הגבישי של קרח הגבישים. אין צורך בידע ביוכימיים או מבני אפריורי של IBP, שיטה זו מאפשרת התאוששות של חלבון פעיל. Ice-מטוהרים שברים חלבון יכול לשמש ליישומים במורד הזרם כולל זיהוי של PEPרצפים גאים ידי ספקטרומטריית מסה ואת לאנליזה ביוכימית של חלבונים מקומיים.
Introduction
קרח מחייב חלבונים (IBPs) הם משפחה מגוונת של חלבונים מגן כי התגלו מספר אורגניזמים כולל צמחים 1, חרקים 2, דגים 3, חיידקים 4. תכונת המפתח של חלבונים אלה היא היכולת הייחודית שלהם במיוחד וביעילות לספוג גבישי קרח, שינוי הצמיחה שלהם. יש IBPs כמה תכונות מתועדות, עם שתי היסטרזיס התרמית להיות המאופיין ביותר היטב (TH) והעיכוב-recrystallization הקרח (IRI). פעילות TH הוא ציינה ביתר קלות ב IBPs יוצר חיות הקפאה-סובלנות. תוצאות פעילות זו בהורדה של נקודת הקיפאון של נוזלי הדם או ביניים אורגניזמים כדי למנוע קפיאה. לעומת זאת, ב אורגניזמים הקפאה-סובלנית, שבהכרח יהיה להקפיא בטמפרטורות שמתחת לאפס, IBPs נראה כי פעילות TH נמוכה. למרות פעילות TH הנמוכה, פעילות IRI גבוהה להגביל זעקת קרחצמיחת Stal קרובות הוא ציין עם חלבונים אלה. עבור האורגניזם הקפאת-סובלנית, פעילות IRI זה כנראה עוזר להגן על התאים מפני צמיחה בלתי מבוקרת של קרח בתאים תאיים.
המודל "כפתור מזרן" יכול לשמש כדי לתאר את המנגנון שבאמצעותו IBPs למנוע הצמיחה של גבישי קרח 5. לפי מודל זה, IBPs במיוחד לספוג אל פני השטח גביש הקרח במרווחים, כך מולקולות המים יכולים רק לשלב עם הסריג הגבישי קרח הגוברת במרחב שבין כבול IBPs. זה יוצר עקמומיות שעושה השילוב של מולקולות מים נוספות שלילי, אירוע זה יכול להיות מתואר על ידי האפקט גבס-תומסון 6. השערת מי clathrate המעוגנים מספקת מנגנון הספציפי המחייב של IBPs אל פני שטח גביש הקרח לפיו הנוכחות של שאריות טעונות, מיקומו במיוחד על קרח חלבון האתר מחייב, תוצאות REOrganization של מולקולות מים כך שהם מתאימים מטוסים אחד או יותר של הסריג הגבישי קרח 7.
ניתן לכמת פעילות TH ידי מדידת ההבדל בין התכה והקפאה לטמפרטורות של גביש קרח אחת בנוכחות של IBP. בעוד פעילות TH היא שיטה מקובלת של הערכת הפעילות של IBPs, פער TH הנמוך המיוצר על ידי המפעל IBPs (בדרך כלל רק חלק קטן של תואר) בדרך כלל דורש ריכוז חלבון גבוה, ציוד מיוחד וניסיון מפעיל. למרות שאינם IBPs עשויה להגביל צמיחה קריסטל קרח, זהו רכוש משותף לכל IBPs ובכך בדיקות לפעילות IRI הוא מסך ראשוני יעיל בנוכחות IBPs, במיוחד עבור אלה עם פעילות TH נמוכה. המתודולוגיה משמש לבדיקת פעילות זו ידועה בשם "assay מעיכה", לפי מדגם חלבון מוקפא פלאש לייצר בשכבה של גבישי קרח קטנים, אשר נצפו על פני תקופה של זמן כדי לקבוע אםצמיחת קריסטל קרח מוגבלת. בניגוד לשיטות אחרות לשמש מסך מדגם רקמות מקור בנוכחות IBPs, טכניקה זו ישימה ריכוזי חלבון נמוך בטווח של 10-100 ng, משתמש בציוד מפוברק בקלות, ומייצר נתונים במהירות ובקלות פרשו. עם זאת, חשוב להדגיש כי assay זה מספק מסך ראשוני IBPs שצריך ואחריו קביעת TH ועיצוב קריסטל קרח.
בידודו של חלבונים ילידי מאתגר, הדורש לעתים קרובות מידע לגבי תכונות מבניות ביוכימיים של חלבון של עניין. הזיקה של IBPs עבור קרח מאפשרת הבידוד של חלבונים אלה באמצעות קרח כמצע למטרות טיהור. מאחר ורוב המולקולות נדחפים קדימה של גבול קרח המים במהלך גדילת גבישי קרח, צמיחה איטית של חצי כדור ארץ קרח בנוכחות של תוצאות מדגם IBP במדגם פערים מטוהר, נטול quantit הגדולies של מזהם חלבונים מומסים. שיטה זו שימשה לזהות IBPs מפני חרקים 8, 9, 10, 11 חיידקים, דגים 12 וצמחים 13, 14. בנוסף, שברים מועשר IBP מושגת באמצעות שיטה זו יכולה לשמש גם עבור ניתוח ביוכימיים במורד הזרם. מאמר זה מתאר את זיהוי של IBPs בצמחים באמצעות האינדוקציה וסחיטה IBPs, ניתוח של פעילות IRI כדי לאשר את קיומו של חלבונים, ואת הבידוד של חלבונים באמצעות טיהור זיקת קרח.
Protocol
Representative Results
Discussion
לניתוח והטיהור המוצלח של IBPs, חשוב להבין את טבעו רגיש לטמפרטורה של כמה חלבונים אלה. צמח מסוים IBPs ולהיות יציב בטמפרטורה מעל 0 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך התגלגלות, משקע וחוסר פעילות. על מנת לקבל IBPs הפעיל, הוא לעתים קרובות קריטי כי צמחים מעובדים בחדר קר (~ 4 ° C) ודגימות נשמרות …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי מענק NSERC (קנדה) ל VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
