Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung
Summary
Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Eis-bindenden Proteinen aus gefriertoleranten Pflanzen durch die Beurteilung von Eis-Umkristallisation hemmende Aktivität und die anschließende Isolierung von nativem IBPs ice-Affinitätsreinigung verwendet wird.
Abstract
Eis-bindende Proteine (IBPs) gehören zu einer Familie von Stress-induzierten Proteine, die durch bestimmte Organismen Temperaturen unter Null ausgesetzt synthetisiert werden. In Pflanzen treten Frostschäden, wenn extrazelluläre Eiskristalle wachsen, was zu dem Bruch von Plasmamembranen und möglichem Zelltod. Adsorption von IBPs Eiskristalle beschränkt weiteres Wachstum durch ein Verfahren, wie Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI) bekannt ist, um dadurch eine Zellschädigung zu verringern. IBPs zeigt auch die Fähigkeit, den Gefrierpunkt eine Lösung unter dem Gleichgewichtsschmelzpunkt, eine Eigenschaft bekannt als thermische Hysterese (TH) -Aktivität zu drücken. Diese Schutzeigenschaften haben Interesse an der Identifizierung neuer IBPs erhöhten aufgrund ihrer möglichen Verwendung in industriellen, medizinischen und landwirtschaftlichen Anwendungen. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von Pflanzen IBPs durch 1) die Induktion und Extraktion von IBPs in Pflanzengeweben, 2), um das Screening von Extrakten für IRI-Aktivität, und 3) die Isolierung und purification von IBPs. Im Anschluss an die Induktion der IBPs durch geringe Temperaturbelastung, sind Extrakte für IRI Aktivität getestet einen ‚Splat-Tests‘ verwendet, die die Beobachtung von Eiskristallwachstum erlaubt eine Standard-Lichtmikroskop. Dieser Test erfordert eine niedrige Proteinkonzentration und erzeugt Ergebnisse, die erhalten schnell und einfach interpretiert werden, Eis-Bindungsaktivität ein Einstiegsbild bereitzustellen. IBPs Proteine kann dann isoliert werden, verunreinigt durch die Eigenschaft IBPs Verwendung auf Eis, durch eine Technik, ‚ice-Affinitätsreinigung‘ zu adsorbieren genannt. Mit Zelllysaten aus Pflanzenextrakten gesammelt, kann ein Eis Hemisphäre langsam auf einer Messingsonde angebaut werden. Dies beinhaltet IBPs in die kristalline Struktur des polykristallinen Eis. Erfordern a priori keine biochemische oder strukturelle Kenntnis des IBP ermöglicht dieses Verfahren zur Gewinnung von aktivem Protein. Eis-gereinigter Proteinfraktionen können für Downstream-Anwendungen, einschließlich der Identifizierung von pep verwendet werden,tide Sequenzen durch Massenspektrometrie und die biochemische Analyse der nativen Proteine.
Introduction
Eis-bindenden Proteine (IBPs) sind eine mannigfaltige Familie von Schutzproteinen , die in einer Reihe von Organismen , einschließlich Pflanzen , 1, 2 Insekten, Fischen 3 und 4 Mikroben entdeckt wurden. Das Hauptmerkmal dieser Proteine ist ihre einzigartige Fähigkeit, gezielt und effizient zu Eiskristallen, zu modifizieren ihr Wachstum zu adsorbieren. IBPs haben mehrere dokumentierten Eigenschaften, mit den beiden am besten charakterisierten sind thermische Hysterese (TH) und Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI). TH-Aktivität wird leichter in IBPs beobachtet in gefrier intolerant Tieren. Diese Aktivität führt zu einer Absenkung des Gefrierpunktes von Organismen Kreislauf- oder interstitiellen Flüssigkeiten Einfrieren zu verhindern. Im Gegensatz dazu in gefriertoleranten Organismen, die bei Temperaturen unter Null zwangsläufig einfriert, erscheint IBPs niedrig TH-Aktivität zu haben. Trotz der geringen TH-Aktivität, eine hohe Aktivität IRI Eis Schrei zu beschränkenStal Wachstum wird oft mit diesen Proteinen beobachtet. Für die Gefrieren tolerant Organismus, dies vermutlich IRI Aktivität hilft Zellen aus dem unkontrollierten Wachstum von Eis in extrazellulären Kompartimenten zu schützen.
Das „Matratze Schaltfläche“ Modell kann verwendet werden , um den Mechanismus zu beschreiben , durch die IBPs das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern 5. Nach diesem Modell adsorbieren IBPs spezifisch an die Oberfläche von Eiskristallen in Intervallen, so dass Wassermoleküle nur mit den wachsenden Eiskristallen Gittern in dem Raum zwischen gebundener IBPs integrieren. Dadurch entsteht eine Krümmung auf, die der Einbau von zusätzlichen Wassermolekülen ungünstig, ein Ereignis macht, die von dem Gibbs-Thomson – Effekt 6 beschrieben werden kann. Die verankerte Clathrat Wasser Hypothese stellt einen Mechanismus für die spezifische Bindung von IBPs zur Eiskristall Oberfläche, wobei die Anwesenheit von geladenen Resten, insbesondere auf der Protein-Bindungsstelle Eis positioniert ist, ergibt die REOrganisation von Wassermolekülen , so passen sie einer oder mehreren Ebenen des Eises Kristallgitter 7.
TH-Aktivität kann durch Messen der Differenz zwischen dem Schmelz- und Gefriertemperaturen eines einzelnen Eiskristall in Gegenwart eines IBP quantifiziert werden. Während TH-Aktivität ein weithin akzeptiertes Verfahren zum Bewerten der Aktivität von IBPs, der niedrigen TH Spalte durch Pflanzen IBPs hergestellt (in der Regel nur einen Bruchteil eines Grades), die normalerweise erfordert eine hohe Proteinkonzentration, spezialisierte Ausrüstung und Erfahrung des Bedieners. Obwohl nicht-IBPs Eiskristallwachstum beschränken kann, ist es eine Eigenschaft von allen IBPs geteilt und damit für IRI Aktivitätstest wird ein effektiver Anfangsbildschirm für die Anwesenheit von IBPs, insbesondere für diejenigen mit geringer TH-Aktivität. Das verwendete Verfahren, diese Aktivität zu testen, wird als ‚Splat-Tests‘ bekannt, wobei eine Proteinprobe schockgefroren wird eine Monoschicht von kleinen Eiskristallen zu erzeugen, die sie über einen Zeitraum beobachtet werden, um zu bestimmen, obEiskristallwachstums eingeschränkt. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um eine Quelle Gewebeprobe auf das Vorhandensein von IBPs zu screenen, diese Technik zu geringen Proteinkonzentrationen im Bereich von 10-100 ng anwendbar ist, nutzt leicht fabrizierten Ausrüstung, und erzeugt Daten, die schnell und einfach interpretiert wird. Jedoch ist es wichtig zu betonen, dass dieser Test eine Anfangsbildschirm für IBPs bereitstellt, die durch die Bestimmung von TH und Eiskristall Formgebung gefolgt werden soll.
Die Isolierung von nativen Proteinen ist eine Herausforderung und erfordert häufig Informationen über die strukturellen und biochemischen Eigenschaften eines Proteins von Interesse. Die Affinität von IBPs für Eis ermöglicht die Isolierung dieser Proteine Eis als Substrat für Reinigungszwecke verwendet wird. Da die Mehrzahl der Moleküle vor der Eis-Wasser-Grenze während des Wachstums von Eiskristallen, langsamem Wachstum einer Eis-Hemisphäre in Gegenwart einer IBP Probe ergibt eine hochgereinigte Probe geschoben, ohne großen quantities von Proteinen und gelöste Stoffe zu kontaminieren. Diese Methode wurde verwendet IBPs von Insekten 8 zu identifizieren, 9, 10, 11 Bakterien, Fisch und Pflanzen 12 13, 14. Zusätzlich können die IBP-angereicherten Fraktionen durch diese Methode erreicht auch für nachgelagerte biochemische Analyse verwendet werden. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von IBPs in Pflanzen durch die Induktion und Extraktion von IBPs, die Analyse von IRI Aktivität die Anwesenheit von Proteinen und die Isolierung von Proteinen unter Verwendung von Eis Affinitätsreinigung zu bestätigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für die erfolgreiche Analyse und Reinigung von IBPs, ist es wichtig, die temperaturempfindlichen Natur einige dieser Proteine zu verstehen. Bestimmte Pflanzen IBPs instabil bei Temperaturen über 0 ° C, was zu einer Entfaltung, Niederschlags- und Inaktivität. Um aktive IBPs zu erhalten, ist es oft wichtig, dass Pflanzen in einem kalten Raum verarbeitet werden (~ 4 ° C) und die Proben werden auf Eis gehalten, während der Experimente. Ein weiterer zu berücksichtigender Faktor bei der Rohlysate Ganzzell verwend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von einem NSERC (Kanada) Zuschuss VKW finanziert.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
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