Identificação de Proteínas de gelo Planta de ligao por meio da avaliação da Inibição de gelo-recristalização e isolamento utilizando purificação por afinidade de gelo
Summary
Este documento descreve a identificação de proteínas de ligação de gelo a partir de plantas freeze-tolerantes através da avaliação da actividade de inibição de recristalização de gelo e subsequente isolamento de IBPs nativas usando gelo purificação por afinidade.
Abstract
proteínas de ligação de gelo (IBPs) pertencem a uma família de proteínas induzidas por stress que são sintetizados por determinados organismos expostos a temperaturas abaixo de zero. Em plantas, danos causados por congelamento ocorre quando os cristais de gelo crescem extracelulares, resultando na ruptura das membranas plasmáticas e possível morte celular. Adsorção de IBPs de cristais de gelo restringe ainda mais o crescimento de um processo conhecido como inibição de gelo-recristalização (IRI), reduzindo desse modo o dano celular. IBPs também demonstram a capacidade de diminuir o ponto de congelação de uma solução abaixo do ponto de fusão de equilíbrio, uma propriedade conhecida como actividade de histerese térmica (TH). Estas propriedades protectoras despertaram o interesse na identificação de novos IBPs devido ao seu potencial uso em aplicações industriais, médicas e agrícolas. Este artigo descreve a identificação de planta IBPs através de 1) a indução e extracção de IBPs em tecido vegetal, 2) o rastreio de extractos de actividade IRI, e 3) o isolamento e Purificação de IBPs. Após a indução de IBPs por exposição a baixa temperatura, extratos são testados quanto à actividade RII usando um 'ensaio de esmagamento', o que permite a observação do crescimento do cristal de gelo utilizando um microscópio de luz padrão. Este ensaio necessita de uma baixa concentração de proteína e gera resultados que são obtidos rapidamente e facilmente interpretadas, proporcionando uma tela inicial de actividade de ligação de gelo. IBPs pode então ser isolado a partir de proteínas contaminantes, utilizando a propriedade de IBPs para adsorver a gelo, por meio de uma técnica chamada de 'purificação de gelo-afinidade'. Utilizando lisados de células recolhidos a partir de extractos de plantas, um hemisfério de gelo pode ser crescido lentamente em uma sonda de latão. Esta incorpora IBPs na estrutura cristalina do gelo policristalino. Que não requer um conhecimento ou bioquímica estrutural priori do IBP, este método permite a recuperação de proteína activa. fracções de proteína purificada de gelo pode ser utilizado para aplicações a jusante, incluindo a identificação de pepsequências de marés por espectrometria de massa e a análise bioquímica de proteínas nativas.
Introduction
Proteínas de ligação de gelo (IBPs) são uma família diversa de proteínas protectoras que foram descobertas em uma série de organismos, incluindo plantas, insectos 1 2, 3, peixes e micróbios 4. A principal característica destas proteínas é a sua capacidade única de adsorver especificamente e eficientemente a cristais de gelo, modificando o seu crescimento. IBPs têm várias propriedades documentados, com os dois mais bem caracterizado sendo histerese térmica (TH) e a inibição de gelo-recristalização (IRI). actividade TH é mais facilmente observado em IBPs produzidos em animais freeze-intolerante. Esta actividade resulta no abaixamento do ponto de congelação de fluidos intersticiais ou circulatórias dos organismos para evitar o congelamento. Em contraste, nos organismos freeze-tolerantes, que vai, inevitavelmente, congelar a temperaturas abaixo de zero, IBPs parecem ter baixa actividade TH. Apesar da baixa actividade TH, uma elevada actividade de IRI para restringir grito geloStal é freqüentemente observado com essas proteínas. Para o organismo tolerante ao congelamento, esta actividade IRI presumivelmente ajuda a proteger as células do crescimento descontrolado de gelo em compartimentos extracelulares.
O "botão de colchão" modelo pode ser usado para descrever o mecanismo pelo qual IBPs impedir o crescimento de cristais de gelo 5 . Sob este modelo, os IBPs adsorvem-se especificamente à superfície do cristal de gelo a intervalos, de tal modo que as moléculas de água só podem incorporar-se com a rede de cristais de gelo crescente no espaço entre os IBPs ligados. Isto cria uma curvatura que torna a incorporação de moléculas de água adicionais desfavoráveis, um evento que pode ser descrito pelo efeito Gibbs-Thomson 6 . A hipótese de águas de clatrato ancoradas proporciona um mecanismo para a ligação específica de IBPs à superfície de cristal de gelo, pelo que a presença de resíduos carregados, especificamente posicionada no local de ligação de gelo de proteína, resulta na reoRGANIZAÇÃO de moléculas de água assim que combinam um ou mais planos da estrutura de cristal de gelo 7.
actividade TH pode ser quantificado através da medição da diferença entre a fusão e temperaturas de congelação de um único cristal de gelo na presença de um IBP. Embora a actividade TH é um método amplamente aceite de avaliar a actividade de IBPs, o fosso baixo TH produzido pela planta IBPs (normalmente apenas uma fracção de um grau) normalmente requer uma concentração de proteína elevada, equipamento especializado e experiência do operador. Embora não IBPs pode restringir o crescimento de cristais de gelo, que é uma propriedade partilhada por todos os IBPs e, assim, o teste para a actividade de IRI é uma tela inicial eficaz para a presença de IBPs, especialmente para aqueles com baixa actividade TH. A metodologia utilizada para testar esta actividade é conhecido como um 'ensaio de esmagamento', através do qual uma amostra de proteína é congelado rapidamente para produzir uma monocamada de pequenos cristais de gelo, os quais são observados durante um período de tempo para se determinarO crescimento do cristal de gelo é restrito. Ao contrário de outros métodos usados para pesquisar uma amostra de tecido de origem para a presença de IBPs, esta técnica é aplicável a baixas concentrações de proteína no intervalo de 10-100 ng, utiliza equipamento facilmente fabricado e gera dados que são rápida e facilmente interpretados. No entanto, é importante ressaltar que este ensaio proporciona uma primeira tela para IBPs que deve ser seguida pela determinação de TH e formação de cristais de gelo.
O isolamento de proteínas nativas é desafiador, muitas vezes requerendo informação sobre as propriedades estruturais e bioquímicas de uma proteína de interesse. A afinidade de IBPs por gelo permite o isolamento destas proteínas utilizando gelo como substrato para fins de purificação. Uma vez que a maioria das moléculas são empurradas à frente da fronteira gelo-água durante o crescimento de cristais de gelo, o crescimento lento de um hemisfério de gelo na presença de uma amostra IBP resulta numa amostra altamente purificada, desprovida de grande quantits de proteínas contaminantes e solutos. Este método tem sido utilizado para identificar IBPs de insectos 8, 9, 10, 11 bactérias, peixes e plantas 12 13, 14. Além disso, as fracções de IBP-enriquecidos obtidos através deste método também podem ser utilizados para análise bioquímica jusante. Este documento descreve a identificação de IBPs em plantas através da indução e extracção de IBPs, a análise da actividade IRI para confirmar a presença de proteínas, e o isolamento de proteínas utilizando a purificação por afinidade de gelo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a análise bem sucedida e purificação de IBPs, é importante compreender a natureza sensível à temperatura de algumas destas proteínas. Determinada planta IBPs tornar-se instável a temperaturas acima de 0 ° C, resultando no desdobramento, precipitação e inactividade. A fim de obter IBPs activas, é muitas vezes crítico que as plantas são transformadas numa sala fria (~ 4 ° C) e as amostras são mantidas em gelo durante a experimentação. Outro factor a considerar quando se usa lisados brutos de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma concessão NSERC (Canadá) a VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
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