Identificazione di Plant proteine Ice vincolante attraverso la valutazione di Ice-ricristallizzazione inibizione e isolanti Utilizzando Ice-affinità Purificazione
Summary
Questo documento delinea l'identificazione di proteine di ghiaccio-binding da piante freeze-tolleranti attraverso la valutazione di attività di inibizione ghiaccio ricristallizzazione e successivo isolamento di IBPS native che utilizzano la purificazione ghiaccio affinità.
Abstract
proteine ghiaccio-binding (IBPS) appartengono a una famiglia di proteine indotte da stress che sono sintetizzate da alcuni organismi esposti a temperature inferiori allo zero. Nelle piante, danni da congelamento si verifica quando i cristalli di ghiaccio extracellulari crescere, con conseguente rottura delle membrane plasmatiche ed eventuale morte cellulare. Adsorbimento di IBPS di cristalli di ghiaccio limita ulteriormente la crescita con un processo noto come inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI), riducendo così i danni cellulari. IBPS inoltre dimostrare la capacità di abbassare il punto di congelamento di una soluzione al di sotto del punto di fusione di equilibrio, una proprietà nota come isteresi termica (TH) attività. Queste proprietà protettive hanno sollevato interesse per l'identificazione di nuovi IBPS causa del loro potenziale utilizzo in applicazioni industriali, mediche e agricole. Questo documento descrive l'identificazione di pianta IBPS attraverso 1) l'induzione ed estrazione di IBPS nei tessuti vegetali, 2) lo screening di estratti per attività IRI, e 3) l'isolamento e Purificazione di IBPS. Seguendo l'induzione di IBPS da esposizione a bassa temperatura, estratti sono testati per l'attività IRI utilizzando un 'analisi splat', che consente l'osservazione di crescita dei cristalli di ghiaccio utilizzando un microscopio ottico standard. Questo test richiede una bassa concentrazione di proteine e genera risultati che si ottengono in modo rapido e facile interpretazione, fornendo una schermata iniziale per ghiaccio attività di legame. IBPS può quindi essere isolato da proteine contaminanti utilizzando la proprietà di IBPS di adsorbimento sul ghiaccio, attraverso una tecnica chiamata 'ice-affinità di purificazione'. Utilizzando lisati cellulari raccolti da estratti di piante, un emisfero ghiaccio può essere coltivata lentamente su una sonda di ottone. Questo incorpora IBPS nella struttura cristallina del ghiaccio policristallino. Non richiede una conoscenza a priori biochimica o strutturale della IBP, questo metodo consente il recupero di proteina attiva. frazioni proteiche ghiaccio-purificato può essere utilizzato per applicazioni a valle comprendono l'identificazione di pepsequenze marea mediante spettrometria di massa e analisi biochimica delle proteine native.
Introduction
Proteine ghiaccio-binding (IBPS) sono una famiglia di proteine diverse protettivi che sono stati scoperti in un numero di organismi comprese le piante 1, 2 insetti, pesci 3, 4 e microbi. La caratteristica fondamentale di queste proteine è la loro capacità unica di assorbire specificamente ed efficiente per cristalli di ghiaccio, modificando la loro crescita. IBPS hanno diverse proprietà documentati, con i due più ben caratterizzati essere isteresi termica (TH) e l'inibizione ghiaccio ricristallizzazione (IRI). attività di TH è più facilmente osservata in IBPS prodotte in animali freeze-intolleranti. Questa attività comporta l'abbassamento del punto di congelamento di fluidi circolatori o interstiziali organismi per evitare il congelamento. Al contrario, negli organismi freeze-tolerant, che inevitabilmente congelare a temperature sotto lo zero, IBPS sembrano avere bassa attività TH. Nonostante la bassa attività TH, una elevata attività IRI per limitare grido di ghiacciocrescita stal viene spesso osservato con queste proteine. Per l'organismo freeze-tolerant, questa attività aiuta IRI presumibilmente proteggere le cellule dalla crescita incontrollata di ghiaccio in compartimenti extracellulari.
Il modello "pulsante materasso" può essere usato per descrivere il meccanismo con cui IBPS prevenire la crescita di cristalli di ghiaccio 5. Secondo questo modello, IBPS specificamente adsorbe sulla superficie cristalli di ghiaccio ad intervalli, in modo tale che le molecole d'acqua possono incorporare solo con la crescente reticolo cristallino ghiaccio nello spazio tra legata IBPS. Questo crea una curvatura che rende l'incorporazione di molecole d'acqua supplementari sfavorevole, un evento che può essere descritto con l'effetto Gibbs-Thomson 6. Il ancorato acque clatrati ipotesi fornisce un meccanismo per il legame specifico IBPS alla superficie del cristallo di ghiaccio per cui la presenza di residui carichi, in particolare posizionato nel sito di legame ghiaccio proteine, provoca la REOrganization di molecole d'acqua in modo da corrispondere a uno o più piani del reticolo cristallino ghiaccio 7.
attività TH può essere quantificata misurando la differenza tra la fusione e temperature di congelamento di un singolo cristallo di ghiaccio in presenza di un IBP. Mentre l'attività TH è un metodo ampiamente accettato di valutare l'attività di IBPS, il divario partire TH prodotta dall'impianto IBPS (in genere solo una frazione di grado) richiede normalmente una concentrazione proteica alta, attrezzature specializzate ed esperienza dell'operatore. Sebbene non IBPS possono limitare la crescita dei cristalli di ghiaccio, è una proprietà condivisa da tutti IBPS e prove quindi per attività IRI è una schermata iniziale effettivo per la presenza di IBPS, soprattutto per quelli con bassa attività TH. La metodologia utilizzata per testare questa attività è noto come un 'analisi splat', in cui un campione di proteina è istantaneo congelato per produrre un monostrato di piccoli cristalli di ghiaccio, che si osservano in un periodo di tempo per determinare secrescita dei cristalli di ghiaccio è limitato. A differenza di altri metodi utilizzati per lo screening di un campione di tessuto di origine per la presenza di IBPS, questa tecnica è applicabile a basse concentrazioni di proteine nell'intervallo 10-100 ng, utilizza attrezzature facilmente fabbricato, e genera dati che vengono rapidamente e facilmente interpretato. Tuttavia, è importante sottolineare che questo saggio fornisce una schermata iniziale per IBPS che devono essere seguite dalla determinazione di TH e sagomatura cristalli di ghiaccio.
L'isolamento di proteine native è impegnativo, spesso richiedendo informazioni riguardanti le proprietà strutturali e biochimiche di una proteina di interesse. L'affinità di IBPS di ghiaccio consente l'isolamento di queste proteine usando ghiaccio come substrato per scopi di purificazione. Poiché la maggior parte delle molecole vengono spinti in avanti del limite ghiaccio-acqua durante la crescita dei cristalli di ghiaccio, la crescita lenta di un emisfero ghiaccio in presenza di un IBP campione comporti un campione altamente purificato, privo di grandi quantitzioni del proteine contaminanti e soluti. Questo metodo è stato utilizzato per identificare IBPS da insetti 8, 9, 10, 11, batteri pesci 12 e piante 13, 14. Inoltre, le frazioni arricchite IBP-conseguiti mediante questo metodo può essere utilizzato anche per l'analisi biochimica valle. Questo documento descrive l'identificazione di IBPS nelle piante attraverso l'induzione ed estrazione di IBPS, analisi dell'attività IRI per confermare la presenza di proteine, e l'isolamento di proteine usando purificazione di affinità ghiaccio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per l'analisi di successo e purificazione di IBPS, è importante comprendere la natura sensibile alla temperatura di alcune di queste proteine. Determinate macchine IBPS diventa instabile a temperature superiori a 0 ° C, con conseguente dispiegamento, precipitazione e inattività. Per ottenere IBPS attive, è spesso importante che le piante vengono elaborati in una stanza fredda (~ 4 ° C) e campioni sono mantenuti in ghiaccio durante la sperimentazione. Un altro fattore da considerare quando si utilizzano cellule …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC (Canada) riconoscere ai VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
