Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering
Summary
Dit document beschrijft de identificatie van ijs bindende eiwitten uit freeze-tolerante planten door de beoordeling van ijs herkristallisatie inhibitie activiteit en daaropvolgende isolatie van natieve IBP gebruik ice-affiniteitzuivering.
Abstract
Ice-bindende eiwitten (IBP) behoren tot een familie van stress-geïnduceerde eiwitten die worden gesynthetiseerd door bepaalde organismen blootgesteld aan temperaturen onder nul. In planten vorstschade ontstaat wanneer extracellulaire ijskristallen groeien, wat resulteert in het breken van plasmamembranen en eventuele celdood. Adsorptie van IBP ijskristallen beperkt verdere groei door een proces dat ijs herkristallisatie inhibitie (IRI), waardoor celbeschadiging verminderen. IBP laten ook de mogelijkheid om het vriespunt van de oplossing beneden het evenwicht smeltpunt, een eigenschap bekend als thermische hysterese (Th) activiteit onderdrukken. Deze beschermende eigenschappen hebben belangstelling voor de identificatie van nieuwe IBP's verhoogd als gevolg van hun potentieel gebruik in industriële, medische en agrarische toepassingen. Dit document beschrijft de identificatie van planten IBP m 1) de inductie en extractie van IBP in plantenweefsel, 2) de screening van extracten van IRI activiteit en 3) het isoleren en purificatie van IBP's. Na de inductie van IBP door blootstelling lage temperatuur worden extracten getest op activiteit met behulp van een IRI 'splat assay', waarbij de observatie van de groei van ijskristallen met een standaard lichtmicroscoop maakt. Deze test vereist een lage eiwitconcentratie genereert resultaten verkregen die snel en gemakkelijk te interpreteren, verschaffen een eerste screening voor ijs bindingsactiviteit. IBP kan daarna worden geïsoleerd uit contaminerende eiwitten door gebruik van de eigenschap IBP adsorbeert ijs, via een techniek genaamd "ice-affiniteitzuivering. Gebruik cellysaten vanuit plantenextracten, kan een ijs hemisfeer traag worden gekweekt op een koperen probe. Dit omvat IBP in de kristallijne structuur van de polykristallijne ijs. Waarbij geen a priori biochemische of structurele kennis van de IBP maakt deze werkwijze voor het terugwinnen van actief eiwit. -Ijs gezuiverde eiwitfracties kunnen worden gebruikt voor verdere toepassingen inclusief het bepalen van peptide sequenties door massaspectrometrie en biochemische analyse van natieve eiwitten.
Introduction
Ice-bindingseiwitten (IBP) zijn een diverse familie van beschermende eiwitten die zijn ontdekt in een aantal organismen, waaronder planten 1, 2 insecten, vissen 3 en 4 microben. Het belangrijkste kenmerk van deze eiwitten is hun unieke mogelijkheid om gericht en efficiënt adsorberen aan ijskristallen, het wijzigen van hun groei. IBP meerdere gedocumenteerde eigenschappen, met de twee meest kenmerk dat thermische hysterese (TH) en ijs herkristallisatie inhibitie (IRI). TH activiteit gemakkelijker waargenomen IBP geproduceerd in freeze-intolerant dieren. Deze activiteit leidt tot verlaging van het vriespunt van de bloedsomloop of interstitiële vloeistoffen organismen om bevriezing te voorkomen. Dit in tegenstelling tot freeze-tolerante organismen, wat onvermijdelijk zal bevriezen bij temperaturen onder het vriespunt, IBP's lijken te laag TH activiteit hebben. Ondanks de lage TH activiteit, een hoge IRI activiteit ijsk beperkenstal groei wordt vaak waargenomen met deze eiwitten. Voor de freeze-tolerante organisme, dit IRI activiteit waarschijnlijk helpt cellen tegen de ongecontroleerde groei van ijs in extracellulaire compartimenten.
De "matras toets" model kan worden gebruikt om het mechanisme waarmee IBP de groei van ijskristallen 5 beschrijven. In dit model IBP specifiek te adsorberen aan het ijskristal aanbrengen met tussenafstanden, zodat watermoleculen alleen nemen de groeiende ijs kristalrooster in de ruimte tussen gebonden IBP. Hierdoor ontstaat een kromming die de opname van extra watermoleculen ongunstig maakt, een gebeurtenis die kan worden beschreven door de Gibbs-Thomson effect 6. De verankerde water clathraat hypothese verschaft een mechanisme voor de specifieke binding van IBP aan het ijskristal oppervlak waardoor de aanwezigheid van geladen residuen, in het bijzonder geplaatst op het eiwit bindingsplaats ijs, resulteert in de reorganisatie watermoleculen zodat ze overeenkomen met een of meer vlakken van het ijskristal rooster 7.
TH activiteit kan worden gekwantificeerd door het verschil tussen de smelt- en vriespunt van een ijskristal in aanwezigheid van een IBP. Terwijl TH-activiteit is een algemeen aanvaarde methode voor het evalueren van de activiteit van IBP, de lage TH spleet geproduceerd door planten IBP (typisch slechts een fractie van een graad) gewoonlijk een hoge eiwitconcentratie, gespecialiseerde apparatuur en bestuurderservaring. Hoewel niet-IBP ijs kristalgroei beperken, is een eigenschap die door alle IBP en dus testen op IRI Activiteit effectief startscherm voor de aanwezigheid van IBP, met name voor de lage TH activiteit. De gebruikte deze activiteitstest methodologie is bekend als een 'splat assay', waarbij een eiwitmonster wordt snel ingevroren op een monolaag van kleine ijskristallen, die worden gemeten over een tijdsperiode te bepalen of producerenijs kristalgroei beperkt. In tegenstelling tot andere methoden om een bron weefselmonster op de aanwezigheid van IBP screenen Deze techniek is toepasbaar op lage eiwitconcentraties in het traject van 10-100 ng, gebruik gemakkelijk vervaardigde materiaal en genereert data die snel en gemakkelijk wordt geïnterpreteerd. Het is echter belangrijk te benadrukken dat deze test geeft een eerste scherm IBP die moet worden gevolgd door het bepalen van TH en ijskristal vormen.
De isolatie van natieve eiwitten is een uitdaging, waarvoor vaak informatie met betrekking tot de structurele en biochemische eigenschappen van een eiwit van belang. De affiniteit van IBP ijs maakt de isolatie van deze eiwitten met behulp van ijs als substraat voor zuiveringsdoeleinden. Aangezien de meeste moleculen vóór het ijswater begrenzing geduwd tijdens de groei van ijskristallen, trage groei van een ijs-halfrond in aanwezigheid van een IBP monster resulteert in een zeer gezuiverd monster, zonder grote quantitven van verontreinigende proteïnen en opgeloste stoffen. Deze werkwijze is gebruikt om IBP identificeren insecten 8, 9, 10, 11 bacteriën, vissen en planten 12 13 14. Daarnaast is de IBP-verrijkte fracties die met deze werkwijze kan ook worden gebruikt voor downstream biochemische analyse. Dit document beschrijft de identificatie van IBP in planten via de inductie en extractie van IBP, analyse van IRI activiteit de aanwezigheid van eiwitten, en de isolatie van eiwitten met behulp van ijs affiniteitzuivering bevestigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de succesvolle analyse en zuivering van IBP's, is het belangrijk om de temperatuur-gevoelige aard van sommige van deze eiwitten te begrijpen. Bepaalde plantaardige IBP instabiel bij temperaturen boven 0 ° C, wat resulteert in ontvouwen, neerslag en inactiviteit. Om actieve IBP te verkrijgen, is het vaak belangrijk dat planten worden verwerkt in een koude ruimte (~ 4 ° C) en monsters worden op ijs gehouden tijdens de experimenten. Een andere factor die meespeelt bij gebruik van hele cellen ruwe lysaten is de a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een NSERC (Canada) subsidie aan VKW.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
References
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
