Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Summary

Dette papir beskriver identifikation af is-bindende proteiner fra freeze-tolerante planter gennem vurderingen af ​​is-omkrystallisation inhiberingsaktivitet og efterfølgende isolering af native IBPS anvender is-affinitetsoprensning.

Abstract

Is-bindende proteiner (IBPS) tilhører en familie af stressinducerede proteiner, der syntetiseres af visse organismer, der udsættes for frost. I planter, frostskader opstår, når ekstracellulære iskrystaller vokser, hvilket resulterer i brud af plasmamembraner og eventuel celledød. Adsorption af IBPS til iskrystaller begrænser yderligere vækst ved en proces kendt som is-omkrystallisation inhibering (IRI), og derved reducere cellulær skade. IBPS demonstrerer også evne til at sænke frysepunktet af en opløsning under ligevægtstemperaturen smeltepunktet, en egenskab kendt som termisk hysterese (TH) aktivitet. Disse beskyttende egenskaber har rejst interesse i identifikationen af ​​hidtil ukendte IBPS grund af deres potentielle anvendelse i industrielle, medicinske og landbrugsmæssige anvendelser. Dette papir beskriver identifikation af plante IBPS gennem 1) induktionen og udvinding af IBPS i plantevæv, 2) screening af ekstrakter til IRI aktivitet, og 3) isolering og purifIcation af IBPs. Efter induktion af IBP'er ved lav temperatur eksponering testes ekstrakter for IRI aktivitet ved anvendelse af en 'splat-analyse', som muliggør observation af iskrystalvækst ved anvendelse af et standardlysmikroskop. Dette assay kræver en lavproteinkoncentration og frembringer resultater, som hurtigt opnås og fortolkes let, hvilket tilvejebringer en indledende skærm for isbindende aktivitet. IBP'er kan derefter isoleres fra forurenende proteiner ved at udnytte IBP'ernes egenskaber til at adsorbere til is ved hjælp af en teknik kaldet 'isaffinitetsrensning'. Ved anvendelse af cellelysater opsamlet fra planteekstrakter kan en ishalvkugle langsomt dyrkes på en messingprobe. Dette inkorporerer IBP'er i den krystallinske struktur af den polykrystallinske is. Kræver ingen biokemisk eller strukturel viden om IBP'en, giver denne metode mulighed for genopretning af aktivt protein. Isrensede proteinfraktioner kan anvendes til downstream-applikationer, herunder identifikation af peptidevand sekvenser ved massespektrometri og den biokemiske analyse af native proteiner.

Introduction

Is-bindende proteiner (IBPS) er en forskelligartet familie af beskyttende proteiner der er blevet opdaget i en række organismer, herunder planter ^1, insekter ^2, fisk ^3, og mikrober ^4. Det centrale element i disse proteiner er deres enestående evne til specifikt og effektivt adsorbere til iskrystaller, ændre deres vækst. IBPS har flere dokumenterede egenskaber, med de to mest velkarakteriserede være termisk hysterese (TH) og is-omkrystallisation inhibering (IRI). TH aktivitet lettere observeret i IBPS produceret i freeze-intolerant dyr. Denne aktivitet resulterer i sænkning af frysepunktet for organismernes kredsløbs- eller interstitielle væsker for at forhindre frysning. I modsætning hertil i fryse-tolerante organismer, som uundgåeligt vil fryse ved temperaturer under frysepunktet, IBPS synes at have lav TH aktivitet. Trods den lave TH aktivitet, til en høj IRI aktivitet begrænse iskrysstal vækst er ofte observeret med disse proteiner. For fryse-tolerante organisme, denne IRI aktivitet formentlig hjælper med at beskytte celler fra den ukontrollerede vækst af is i ekstracellulære rum.

Den "madras knappen" model kan anvendes til at beskrive den mekanisme hvorved IBPS forhindre vækst af iskrystaller ^5. Under denne model, IBPS specifikt adsorbere til iskrystallen overflade med mellemrum, således at vandmolekyler kun kan optage med den voksende is krystalgitteret i mellemrummet mellem bundet IBPS. Dette skaber en krumning, der gør inkorporering af yderligere vandmolekyler ugunstige, en begivenhed, der kan beskrives ved den Gibbs-Thomson-effekten ^6. Det forankrede clathrathydrater farvande hypotese tilvejebringer en mekanisme til den specifikke binding af IBPS til iskrystallen overflade hvorved tilstedeværelsen af ​​ladede rester specifikt placeret på proteinet is bindingsstedet, resulterer i reorganization af vandmolekyler, så de matcher et eller flere planer af isen krystalgitteret ^7.

TH-aktivitet kan kvantificeres ved at måle forskellen mellem smelte- og frostgrader af en enkelt iskrystal i nærvær af en IBP. Mens TH aktivitet er en bredt accepteret fremgangsmåde til evaluering af aktiviteten af ​​IBPS, den lave TH kampen produceret af planten IBPS (typisk kun en brøkdel af en grad) kræver normalt en høj proteinkoncentration, specialudstyr og operatør erfaring. Selvom ikke-IBPS kan begrænse iskrystalvækst, er det en egenskab deles af alle IBPS og dermed testning for IRI aktivitet er en effektiv indledende screening for tilstedeværelsen af ​​IBPS, især for dem med lav TH-aktivitet. Den anvendte metode til at teste denne virkning er kendt som en 'splat assay', hvorved et protein prøve lynfrosset til frembringelse af et monolag af små iskrystaller, som er observeret over en tidsperiode for at bestemme, omiskrystalvækst er begrænset. I modsætning til andre metoder, der anvendes til at screene en kilde vævsprøve for tilstedeværelsen af ​​IBPS, denne teknik kan anvendes på lave koncentrationer protein i området 10-100 ng, anvender let-fabrikeret udstyr, og genererer data, der er hurtigt og nemt tolkes. Det er imidlertid vigtigt at understrege, at dette assay tilvejebringer en indledende screening for IBPS der bør følges ved bestemmelse af TH og iskrystal formning.

Isolering af native proteiner er udfordrende, hvilket ofte kræver information vedrørende de strukturelle og biokemiske egenskaber af et protein af interesse. Affiniteten af ​​IBPS til ice muliggør isoleringen af ​​disse proteiner ved anvendelse is som et substrat til oprensningsformål. Da hovedparten af ​​molekyler skubbes fremad for grænsen mellem isvand under iskrystalvækst, langsom vækst af et is-halvkugle i nærvær af en IBP prøven resulterer i en højt oprenset prøve, blottet for stor quantiterne af kontaminerende proteiner og opløste stoffer. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til at identificere IBPS fra insekter ^{8, 9, 10,} bakterier ^11, fisk ¹² og planter ^{13, 14.} Desuden kan IBP-berigede fraktioner opnået gennem denne metode også anvendes til nedstrøms biokemisk analyse. Dette papir beskriver identifikationen af ​​IBPS i planter gennem induktion og udvinding af IBPS, at analyse af IRI aktivitet bekræfte tilstedeværelsen af ​​proteiner, og isoleringen af ​​proteiner under anvendelse af is affinitetsoprensning.

Protocol

1. Splat Apparat Setup Fyld en temperatur programmerbar cirkulerende vandbad med ethylenglycol (50% volumen / volumen i vand). BEMÆRK: Grøn automotive ethylenglycol kan anvendes. For at samle det eksterne kammer, anvender isolerede plastrør til at fastgøre vandbad til en dobbeltvægget glasskål. Isolere glasskål med polystyrenskum og tildækkes med en plastpetriskål låg. Skær en 3-4 tommer hul i bunden af ​​polystyren kammeret, således at lyskilden kan ses gennem glasset kammer….

Representative Results

For at lette opsætning, figur 1 og Figur 2 er inkluderet som visuelle repræsentationer af udstyr til IRI analyse og is-affinitetsoprensning hhv. Resultaterne af IRI analyse under anvendelse af ekstrakter opsamlet fra sennep ukrudt med og uden IBPS er afbildet i figur 3. Disse resultater viser, at ekstrakter indsamlet fra sennep ukrudt, som ikke er fryse-tolerant, var ude af stan…

Discussion

For vellykket analyse og oprensning af IBPS, er det vigtigt at forstå den temperaturfølsomme karakter af nogle af disse proteiner. Bestemt plante IBPS bliver ustabile ved temperaturer over 0 ° C, hvilket resulterer i udfoldning, udfældning og inaktivitet. For at opnå aktive IBPS, er det ofte kritisk, at planterne behandles i et koldt rum (~ 4 ° C) og Prøverne opbevares på is under eksperimentering. En anden faktor at overveje ved brug helcelle rålysater er nedbrydningen af ​​proteiner ved endogene proteaser…

Materials

1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/ camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 µm particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic