حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا<em> في المختبر</em> من البروتينات النسخ المتماثل الجراثيم T7
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
تكرار الحمض النووي هو ميزة الحفظ لجميع أشكال الحياة الخلوية. في حين هوية وعدد من مكونات النسخ المتماثل تختلف على نطاق واسع، ويشارك في الآليات العامة عبر تطور 1. هنا، نحن تصف والتجارب الحركية متقطعة القائم على هلام، وذلك باستخدام ركائز المشعة، التي تهدف إلى فهم حركية توليف الحمض النووي متخلفة حبلا في المختبر عن طريق مكونات جسيم مكرر T7. آلية تكرار T7 عاثية بسيطة جدا، تتكون من البروتينات أربعة فقط (بوليميريز الحمض النووي، GP5، وعامل processivity لها، كولاي thioredoxin، وGP4-بريميز هيليكاز bifunctional، وبروتين DNA واحد الذين تقطعت بهم السبل ملزم، GP2. 5) 2. هذه الميزة تجعل من نظام نموذجا جذابا لدراسة الآليات البيوكيميائية الحفظ تشارك في تكرار الحمض النووي.
ويتم التركيز بشكل خاص على تشكيل الاشعال ريبونوكليوتيد التي كتبها T7 الحمض النووي بريميز، وهو حرجةخطوة لتر في الشروع في تركيب الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن ينظر أيضا في استخدام هذه البادئات من قبل البلمرة T7 الحمض النووي أو البروتينات النسخ الأخرى عن طريق إشراكها في خليط التفاعل. وT7 بريميز-هيليكاز، GP4، يحفز تشكيل الاشعال لتخليق الحمض النووي في تسلسل الحمض النووي محددة تسمى المواقع الاعتراف بريميز، أو استراتيجية الحد من الفقر، (5'-GTC-3 '). والسيتوزين في استراتيجية الحد من الفقر هو خفي، فمن الضروري للاعتراف الموقع، ولكن لا يتم نسخ ذلك في المنتج 3. الخطوة الأولى في التوليف التمهيدي من GP4 تتضمن تشكيل ثنائي النوكليوتيد pppAC، التي امتدت بعد ذلك لأرتب، وفي نهاية المطاف إلى الاشعال رباعي النوكليوتيد الوظيفية pppACCC، pppACCA، أو pppACAC تبعا لتسلسل في قالب 4. ويمكن بعد هذه الاشعال يتم استخدامها من قبل البلمرة T7 الحمض النووي للشروع في تركيب الحمض النووي، والذي هو أيضا عملية بمساعدة GP4 5، 6. في هذا الصدد، وبريميزنطاق استقرار tetraribonucleotides قصيرة للغاية مع القالب، ومنع التفكك، ويشارك البلمرة DNA بطريقة تؤدي إلى تأمين التمهيدي / القالب إلى موقع نشط 7 البلمرة. وتتكرر هذه الخطوات (RNA التوليف التمهيدي، عمليتي التحول التمهيدي لالبلمرة، والإرشاد) في دورات متعددة لتكرار حبلا متخلفة ويجب أن ينسق مع تكرار حبلا الرائدة.
المقايسات الموصوفة هنا هي حساسة للغاية، ويمكن أداؤها في إطار زمني المعتدل. ومع ذلك، فهي نسبيا منخفضة الإنتاجية وعناية كبيرة يجب أن تمارس في الاستخدام والتخلص من المواد المشعة. اعتمادا على السرعة التي حصيلة التفاعل، يمكن للمرء أن يستخدم أداة لإخماد السريع لتحقيق العينات في فترات زمنية قابلة للتحليل مغزى من الدورات وقت رد الفعل إما في ثابت أو دولة ما قبل مستقرة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا المقايسات وصفها هنا لتقديم evidenc(ه) من أهمية إطلاق التمهيدي من المجال بريميز من GP4 في بدء شظايا أوكازاكي. بالإضافة إلى ذلك، وجدنا دليلا على وجود دور تنظيمي لالحمض النووي واحد الذين تقطعت بهم السبل T7 البروتين، gp2.5 ملزمة، في تعزيز تشكيل التمهيدي كفاءة واستخدام 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
العامل الأكثر أهمية في أداء هذه التجارب هو توافر انزيم المنقى نشطة للغاية. خلال عملنا مع GP4، على سبيل المثال، وجدنا أن تخزين الإنزيم المنقى في المخزن (20 ملي فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي EDTA، 1 ملم DTT) التي تحتوي على 50٪ الجلسرين في -20 درجة مئوية يؤدي إلى انخف?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
