보온재 가닥 DNA 합성의 속도론<em> 체외</em>는 박테리오파지 T7 복제 단백질에 의해
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
DNA의 복제는 모든 세포 삶의 보존 기능입니다. 복제 구성 요소의 ID와 수가 매우 다양하지만, 일반적인 메커니즘이 진화 1에서 공유됩니다. 여기에서는 T7 replisome의 구성 요소에 의해 시험관 내에서 지체 가닥 DNA 합성의 속도론을 이해 목표 방사성 기질을 사용하여, 겔 기반 불연속 동역학 실험을 설명한다. 박테리오파지 T7의 복제 장치는 네 단백질합니다 (DNA 중합 효소, GP5, 그 processivity 인자 대장균 오레 독신, 관능 프리 메이스-헬리 케이즈 GP4 및 단일 가닥 DNA 결합 단백질, GP2 이루어진 매우 간단하다. 5) 2. 이 기능은 DNA 복제에 관여하는 보존 생화학 적 메커니즘을 연구하는 매력적인 모델 시스템을 만든다.
특별한 강조가 T7 DNA에 의해 리보 뉴클레오티드 프라이머의 형성에 배치는 비판적를 프리 메이스DNA 합성의 개시를 L 단계. 또 하나는, 반응 혼합물을 포함하여 T7 DNA 중합 효소 또는 다른 복제 단백질에 의한 이들 프라이머의 사용을 검토 할 수있다. 프리 메이스 T7-헬리 케이즈는 GP4는 프리 메이스 인식 부위 또는 PRS 불리는 특정 DNA 서열의 DNA 합성을위한 프라이머의 형성 (5'-GTC-3 ')를 촉매한다. PRS에서 시토신은 위치의 인식을 위해 필수적이다 애매한 있지만 제품 (3)에 복사되지 않는다. GP4에 의해 프라이머 합성의 첫 번째 단계는 삼량로 확장하고, 결국 기능 tetranucleotide 프라이머로 pppACCC, pppACCA 또는 pppACAC 템플릿 4의 순서에 따라 상기 뉴클레오티드 pppAC의 형성을 포함한다. 이 프라이머는 또한 GP4 보조 공정 (5, 6) 인 DNA 합성을 개시하는 T7 DNA 중합 효소가 사용될 수있다. 이와 관련하여, 프리 메이스도메인은 자신의 해리를 방지 템플릿과 매우 짧은 tetraribonucleotides 안정화 중합 효소 활성 부위 (7)에 프라이머 / 주형 확보에 도움이되는 방식으로 DNA 중합 효소를 결합한다. 이 단계 (RNA 프라이머 합성, 중합 효소에 프라이머 핸드 오프 및 확장)은 지체 가닥을 복제하기 위해 여러 사이클을 반복하고 선도 가닥의 복제를 조정해야합니다.
여기에 설명 된 분석은 매우 민감하고 적당한 시간 내에 수행 될 수있다. 그러나, 그들이 상대적으로 낮은 처리량과 큰 관심은 방사성 물질의 사용 및 폐기에 행사해야합니다. 반응 진행은, 하나의 정상 또는 미리 정상 상태 중 하나의 반응 시간 과정의 의미 분석 의무 시간 스케일에서 샘플을 얻기 위해 신속한 급랭기구를 채용 할 수있는 속도에 따라. 최근에, 우리는 분석은 evidenc를 제공하기 위해 여기에 설명 된 사용오카자키 조각의 시작에 GP4의 프리 메이스 도메인의 프라이머 출시의 중요성 전자. 또한, 우리는 효율적인 프라이머 형성 및 활용 (8)을 촉진, 단백질, gp2.5 바인딩 T7 단일 가닥 DNA에 대한 규제 역할의 증거를 발견했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 실험을 수행하는 가장 중요한 요소는 고도로 정제 된 효소 활성의 이용이다. GP4과의 작업 중에, 예를 들어, -20 ℃에서 50 % 글리세롤을 함유하는 완충액에 정제 된 효소의 스토리지 (20 mM의 인산 칼륨, pH가 7.4, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT)을 찾았의 감소를 초래 몇 개월 동안 준비의 특정 활동. 따라서 우리는 이제 정제 된 25 mM 트리스 – 염산, pH를 7.5, 50 mM의 염화나트륨, 0.1 mM의 EDTA, 1 mM의 TCEP에 GP4, 10 % 글?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
