Cinétique de Lagging brin Synthèse de l'ADN<em> In vitro</em> Par les protéines de réplication bactériophage T7
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
La réplication de l'ADN est une caractéristique conservée de toute la vie cellulaire. Si l'identité et le nombre de composants de réplication varient largement, les mécanismes généraux sont partagés entre l' évolution 1. Ici, nous décrivons, des expériences cinétiques discontinues à base de gel, en utilisant des substrats radioactifs, visant à comprendre la cinétique de la synthèse d'ADN calorifugeage brin in vitro par des composants du replisome T7. La machinerie de réplication du bactériophage T7 est très simple, ne comporte que quatre protéines (l'ADN polymérase, GP5 et son facteur de processivité, E. coli , la thiorédoxine, le GP4 de primase-hélicase bifonctionnels, et la protéine de liaison à l' ADN simple brin, GP2. 5) 2. Cette caractéristique en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes biochimiques conservés impliqués dans la réplication de l'ADN.
L'accent est mis sur la formation d'amorces ribonucléotide par T7 DNA primase, un critical étape dans l'initiation de la synthèse d'ADN. En outre, on peut également étudier l'utilisation de ces amorces par l'ADN polymerase T7 ou d'autres protéines de réplication en les incluant dans le mélange réactionnel. T7-primase de l'hélicase, GP4, catalyse la formation d'amorces pour la synthèse d'ADN au niveau des séquences d'ADN spécifiques appelés sites de reconnaissance primase, ou PRS (5'-CG-3 '). La cytosine dans la SRP est cryptique, il est essentiel pour la reconnaissance du site, mais il n'a pas été copié dans le produit 3. La première étape dans la synthèse de l' amorce par GP4 implique la formation du dinucléotide pppAC, qui est ensuite étendue à un trimère, et éventuellement des amorces tétranucléotidiques fonctionnels pppACCC, pppACCA ou pppACAC en fonction de la séquence dans le gabarit 4. Ces amorces peuvent ensuite être utilisées par l' ADN polymerase T7 pour initier la synthèse de l' ADN, qui est également un procédé assisté par GP4-5, 6. A cet égard, la primasedomaine stabilise les tetraribonucleotides extrêmement courts avec le modèle, ce qui empêche leur dissociation, engage l' ADN polymérase d'une manière favorable à la fixation de la amorce / matrice dans la polymérase du site actif 7. Ces étapes (synthèse de l'ARN primaire, transfert intercellulaire primaire à la polymérase, et extension) sont répétées dans plusieurs cycles de reproduire le brin tardif et doivent être coordonnées avec la réplication du brin leader.
Les dosages décrits ici sont très sensibles et peuvent être effectuées dans un laps de temps raisonnable. Cependant, ils sont relativement bas-débit et un grand soin doit être exercé dans l'utilisation et l'élimination des matières radioactives. En fonction de la vitesse à laquelle le produit de réaction, on pourrait employer un instrument rapide trempe pour atteindre des échantillons à des échelles de temps qui se prêtent à l'analyse significative des cours de temps de réaction soit dans la constante ou l'état pré-stable. Récemment, nous avons utilisé essais décrits ici pour fournir evidence de l'importance de l'amorce la libération du domaine primase de GP4 dans l'initiation des fragments d'Okazaki. De plus, nous avons trouvé la preuve d'un rôle régulateur pour les protéines, de gp2.5 liant le T7 ADN simple brin, dans la promotion de la formation de l' amorce et l' utilisation efficaces 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le facteur le plus important dans la réalisation de ces expériences est la disponibilité d'enzyme purifiée très active. Au cours de notre travail avec GP4, par exemple, nous avons constaté que le stockage de l'enzyme purifiée dans un tampon (20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contenant 50% de glycerol à -20 ° C conduit à une diminution l'activité spécifique de la préparation pendant quelques mois. Par conséquent, nous maintenant flash freeze petites aliquotes de GP4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
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