Kinetik för sackar-sträng DNA-syntes<em> In Vitro</em> Av bakteriofag T7 replikering proteiner
Summary
We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.
Abstract
Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.
Introduction
Replikation av DNA är en bevarad funktion i alla cell liv. Medan identiteten och antalet replikeringskomponenter varierar kraftigt, de allmänna mekanismer delas mellan evolution 1. Här beskriver vi gelbaserade, diskontinuerliga kinetiska experiment, med hjälp av radioaktiva substrat, som syftar till att förstå kinetiken av släpar-strängen DNA-syntes in vitro av komponenter i T7 replisome. Replikeringsmaskineri med bakteriofag T7 är mycket enkel, bestående av endast fyra proteiner (DNA-polymeraset, GP5, och dess processivitet faktor, E.coli thioredoxin, de bifunktionella primas-helikas GP4, och den enkelsträngade DNA-bindande protein, gp2. 5) 2. Denna egenskap gör det till ett attraktivt modellsystem för att studera de konserverade biokemiska mekanismer som är involverade i DNA-replikation.
Särskild tonvikt läggs på bildandet av ribonukleotid primers genom T7-DNA-primas, en critical steg i initiering av DNA-syntes. Dessutom kan man också undersöka användningen av dessa primers av T7 DNA-polymeras eller andra replikerings proteiner genom att inkludera dem i reaktionsblandningen. T7-primas-helikas, GP4, katalyserar bildningen av primrar för DNA-syntes vid specifika DNA-sekvenser kallade primasigenkänningsställen, eller PRS, (5'-GTC-3 '). Cytosin i PRS är kryptisk, är det viktigt för erkännande av platsen, men det är inte kopieras till produkten 3. Det första steget i primer-syntes genom GP4 innefattar bildningen av dinukleotiden pppAC, som sedan förlängs till en trimer, och så småningom till funktionella tetranukleotid primers pppACCC, pppACCA eller pppACAC beroende på sekvensen i mallen 4. Dessa primrar kan sedan användas av T7-DNA-polymeras för att initiera DNA-syntes, som också är en GP4-assisted process 5, 6. I detta avseende, den primasdomän stabiliserar extremt korta tetraribonucleotides med mallen, förhindrar deras dissociation, engagerar DNA-polymeras på ett sätt som bidrar till att säkra primer / mall i polymera aktiva stället 7. Dessa steg (RNA primer syntes, primer handoff till polymeras och förlängnings) upprepas i flera cykler för att replikera den eftersläpande strängen och måste samordnas med replikeringen av den ledande strängen.
De analyser som beskrivs här är mycket känsliga och kan utföras i en måttlig tidsram. Men de är relativt låg genomströmning och stor försiktighet måste iakttas vid användning och bortskaffande av radioaktivt material. Beroende på den hastighet med vilken reaktionen fortskrider, kan man använda en snabbkylnings instrument för att uppnå prover på tidsskalor lämpade för meningsfull analys av reaktionstidsförlopp i antingen konstant eller pre-steady state. Nyligen använde vi analyser som beskrivs här för att ge evidence om vikten av primer frisättning från primas domän GP4 i inledningen av Okazaki fragment. Dessutom fann vi bevis för en reglerande roll för T7 enkelsträngat DNA-bindande protein, gp2.5 i att främja en effektiv primer bildning och användning 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den viktigaste faktorn i att utföra dessa experiment är tillgången på högaktiv renat enzym. Under vårt arbete med GP4, till exempel, fann vi att lagring av det renade enzymet i buffert (20 mM kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) innehållande 50% glycerol vid -20 ° C leder till en minskning av den specifika aktiviteten av preparatet under några månader. Därför har vi nu flash-frysa små alikvoter av renat GP4 i 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP, och 10% glycerol med användnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank C.C.R. laboratory members for comments and S. Moskowitz for figure preparation. This work was supported by National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) and GM54397 (C.C.R.).
Materials
Tris pre-set crystals pH 7.5 |
SIGMA | T4128 | |
| Tris base | SIGMA | 93362 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | SIGMA | G1501 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Mallinckrodt Chemicals | 5958-04 | |
| 1,4-Dithiothreitol | J.T. Baker | F780-02 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | MP Biomedicals | 811030 | |
| (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate | Mallinckrodt Chemicals | 4931-04 | |
| [α-32P] CTP | PerkinElmer | BLU508H | radioactive, take protective measures |
| [γ-32P] ATP | PerkinElmer | BLU502A | radioactive, take protective measures |
| 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Affymetrix | 77100 | four dNTPs part of set |
| 100 mM ATP and CTP | Epicentre | RN02825 | part of NTP set |
| ssDNA constructs | Integrated DNA Technologies | N/A | custom sequences |
| methanol | Macron Fine Chemicals | 3017-08 | |
| formamide | Thermo Scientific | 17899 | |
| bromophenol blue | SIGMA | B8026 | |
| cylene xyanol | SIGMA | X4126 | |
| acrylamide | SIGMA | A9099 | Toxic |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | SIGMA | M7279 | Toxic |
| Urea | Boston Bioproducts | P-940 | |
| Boric acid | Mallinckrodt Chemicals | 2549 | |
| Rapid Quench-Flow Instrument | Kintek Corp. | RQF-3 | |
| Kintek Explorer | Kintek Corp. | N/A | |
| Kaleidagraph | Synergy Software | N/A |
References
- Kornberg, A., Baker, T. A. . DNA replication. , (1992).
- Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Motors, switches, and contacts in the replisome. Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).
- Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).
- Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Primer initiation and extension by T7 DNA primase. EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).
- Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis. Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).
- Kusakabe, T., Richardson, C. C. Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites. J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).
- Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7. Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).
- Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).
- Tabor, S., Richardson, C. C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).
- Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein. J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).
- Frick, D. N., Richardson, C. C. DNA primases. Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).
- Lee, S. J., Richardson, C. C. Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7. J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).
- Cao, W., De La Cruz, E. M. Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics. Sci Rep. 3, 2658 (2013).
- Wang, M. H., Zhao, K. Y. A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations. FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).
- Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).
- Johnson, K. A. A century of enzyme kinetic analysis, 1913. FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).
- Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG. Nucleic Acids Res. 41 (4), e56 (2013).
- Sanyal, G., Doig, P. Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).
