Imaging Neuroner inden Tykke Brain Sektioner Brug af Golgi-Cox Method
Summary
Vi præsenterer en protokol for anvendelse Golgi-Cox farvningsmetode i tykke hjernesnit, for at visualisere neuroner med lange dendritiske træer indeholdt i prøver enkelt væv. To varianter af denne protokol er også præsenteret som involverer cresylviolet modfarvning, og frysning af uforarbejdede hjerner for langtidsopbevaring.
Abstract
Golgi-Cox metode til neuron farvning har været ansat i mere end to hundrede år for at fremme vores forståelse af neuron morfologi inden histologiske hjerneprøver. Mens det foretrækkes ud fra et praktisk perspektiv til fremstilling hjernesnit på den størst mulige tykkelse, for at øge sandsynligheden for at identificere farvede neuroner, der er fuldt indeholdt i enkelte sektioner, denne fremgangsmåde er begrænset fra en teknisk synsvinkel ved arbejdsafstand på høj -magnification mikroskopobjektglas. Vi rapporterer her en protokol til at farve neuroner under anvendelse Golgi-Cox fremgangsmåden i muse hjernesnit, der er skåret ved 500 um tykkelse og at visualisere neuroner i hele dybden af disse sektioner ved hjælp af en opretstående mikroskop udstyret med en høj opløsning 30X 1,05 NA silicone olieimmersionsobjektiv der har en 800 um arbejdsafstand. Vi rapporterer også to nyttige varianter af denne protokol, som kan anvendes til at kontrastfarve overflademonteret hjernesnit med cresylviolet Nissl farvning, eller at fryse hele hjerner til langvarig opbevaring før sektionering og endelig behandling. Den vigtigste protokol og dens to varianter producere farvede tykke hjernesnit, hele som fuld neuron dendritiske træer og dendritceller pigge kan pålideligt visualiseret og kvantificeret.
Introduction
Visualiseringen af individuelle neuroner inden vævsprøver tillader in situ-analyse af neuron morfologiske karakteristika, som i væsentlig grad har avancerede vores forståelse af hjernen, og hvordan det kan påvirkes af endogen sygdom eller eksogene miljøfaktorer. Golgi-Cox farvningsmetode er en omkostningseffektiv, relativt simpelt middel til farvning af en stikprøve af neuroner i hjernen. Først udviklet af Golgi 1 og modificeret af Cox 2 i 1800'erne, har forskere videreudviklet denne teknik i år at producere klare, well-farvede neuroner, der kan anvendes til at visualisere og kvantificere både dendritiske træ morfologi og spidsdensitet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
En vigtig teknisk overvejelse til visualisering af farvede neuroner inden hjernesnit er den maksimale skivetykkelse, som er begrænset af arbejdsafstanden af tilgængelige stor forstørrelse / høj opløsning mikroskopobjektglas. Fælles olie-nedsænkning mål på 60 – 100X range give fremragende opløsning, men er begrænset af deres arbejdsvilkår afstande, der typisk ikke er større end 200 um. Hjernesnit skåret i 200 um område være tilstrækkelig til at visualisere visse neuron typer, der kan være indeholdt i denne skivetykkelse, fx pyramideformede neuroner i lavvandede lag af hjernebarken 10, 11, 12, pyramidale neuroner i CA1-området i det hippocampus 13, 14 og granulerede celler i gyrus dentatus i hippocampus 15. Neuroner med relativt længeredendritiske træer, såsom pyramideneuroner inden dybe lag af hjernebarken, som for muse kan overstige 800 um fra cellen legeme 16, giver en større udfordring, fordi hjerner vil skulle snittet ved en perfekt vinkel at indeholde hele dendritceller træ inden for 200 um skiver. Det kan ikke engang være mulig, hvis en dendritceller eller nogen af sine filialer strækker sig i rostralt eller caudale retning. Selv om det er muligt at løse denne begrænsning ved at spore en neuron på tværs af flere tilstødende hjerne sektioner, denne tilgang introducerer en betydelig teknisk udfordring at tilpasse afsnittene præcist til sporing 17. En mere praktisk fremgangsmåde ville være at visualisere hele neuroner indeholdt i hjernesnit, der er skåret med en større tykkelse.
Vi rapporterer her en teknik til farvning neuroner inden for 400 – 500 um tykke hjerneudsnit fra mus under anvendelse af Golgi-Cox fremgangsmåden og til at visualisere deres morphology anvendelse af en høj opløsning silicium olieimmersionsobjektiv der har en 800 um arbejdsafstand. Golgi-Cox imprægnering og behandlingsprotokol, som vi beskriver er modificeret fra en af de mest citerede moderne protokoller i litteraturen 6. Vores tilgang med tykke hjernesnit tilvejebringer fordelen ved at øge sandsynligheden for at identificere neuroner af enhver type, der er fuldstændigt indeholdt i sektionen. Ud over den vigtigste protokol, vi også præsentere to variationer, der giver enestående fordele: (1) Golgi-Cox farvning med cresylviolet kontrastfarve på overfladen af monterede sektioner, for at definere grænserne for hjerneområder og identificere lag af hjernebarken, og (2) Golgi-Cox farvning med et mellemliggende frysetrin for langtidsopbevaring af imprægnerede hele hjerner før sektionering og endelig behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her en Golgi-Cox farvningsprotokol sammen med to nyttige varianter til visualisering neuroner inden tykke hjernen sektioner. Som vist i Repræsentative resultater, anvendelse af en høj opløsning mål der har en lang 800 um arbejdsafstand muliggør pålidelig visualisering af hele neuroner i hele dybden af hjernesnit skåret ved 500 um. Denne undersøgelse af relativt tykke hjernesnit øger sandsynligheden for, at farvede neuroner af enhver type er fuldstændigt indeholdt i udsnittet, hvilket er sær…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en Discovery Grant til CDCB fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd of Canada (NSERC), en John R. Evans Ledere Fund forskningsinfrastruktur tilskud til CDCB fra Canada Foundation for Innovation (CFI-projekt nummer 30381), og ved en Discovery Grant til NJM fra NSERC. ELL blev understøttet af en Ontario Graduate Scholarship og ved en OVC legat fra Ontario Veterinary College på University of Guelph. CDS blev understøttet af en bachelorstuderende forskningsassistent fra NSERC. ALM blev understøttet af en Alexander Graham Bell Scholarship fra NSERC og ved en OVC legat fra Ontario Veterinary College på University of Guelph.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. . From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
