Imaging Neuronen binnen Dik Brain af met de Golgi-Cox Method
Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van Cox Golgi-kleuring werkwijze dikke hersenpreparaten, teneinde neuronen met lange dendritische bomen opgenomen in één weefselmonsters zichtbaar. Twee varianten van dit protocol worden ook getoond dat cresyl violet tegenkleuring, en het bevriezen van onbewerkte hersenen voor langdurige opslag omvatten.
Abstract
Het Golgi-Cox methode neuron kleuring is gebruikt voor meer dan tweehonderd jaar aan ons begrip van neuron morfologie te bevorderen binnen histologische hersenen monsters. Hoewel het de voorkeur verdient vanuit praktisch oogpunt hersenen secties de grootste dikte materialen te bereiden, teneinde de waarschijnlijkheid van het identificeren bevlekt neuronen die volledig zijn vervat binnen enkele secties verhogen, deze benadering beperkt technisch oogpunt de werkafstand van high -Vergroting microscoop doelstellingen. Wij rapporteren hier een protocol om neuronen te kleuren volgens de methode Golgi-Cox in muizenhersenen secties 500 pm dikte gesneden, en neuronen te visualiseren over de hoogte van die gebieden af met een rechtopstaande microscoop uitgerust met een hoge-resolutie 30X 1,05 NA siliconen olie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Wij rapporteren ook twee nuttige varianten van dit protocol dat kan worden gebruikt om het oppervlak van tegenkleuringgemonteerde hersensecties met cresyl violet Nissl vlek of gehele hersenen voor langdurige opslag bevriezen voorafgaand aan snijden en eindverwerking. De belangrijkste protocol en de twee varianten produceren lood dikke hersencoupes, gedurende welke volledige neuron dendritische bomen en dendriet stekels betrouwbaar kan worden gevisualiseerd en gekwantificeerd.
Introduction
De visualisatie van de individuele neuronen in weefselmonsters maakt het mogelijk om in situ analyse van neuron morfologische kenmerken, die aanzienlijk heeft geavanceerde ons begrip van de hersenen en hoe het kan worden beïnvloed door endogene ziekte of exogene omgevingsfactoren. Het Golgi-Cox kleuringsmethode een kosteneffectief, relatief eenvoudig middels kleuren van een steekproef van neuronen in de hersenen. Eerst ontwikkeld door Golgi 1 en gewijzigd door Cox 2 in de jaren 1800, hebben de onderzoekers verder verfijnd deze techniek door de jaren heen aan duidelijke, goed gekleurde neuronen die kunnen worden gebruikt om te visualiseren en te kwantificeren zowel dendritische boom morfologie en de wervelkolom dichtheid 3, 4 te produceren, 5, 6, 7, 8, 9.
Een belangrijke technische overweging voor de visualisatie van gekleurde neuronen in hersenen secties de maximale plakdikte, die wordt begrensd door de werkafstand beschikbare sterke vergroting / microscoopobjectieven hoge resolutie. Gemeenschappelijke doelstellingen olie-immersie in de jaren 60 – 100X bereik te bieden uitstekende resolutie, maar worden beperkt door hun werkafstanden die zijn meestal niet groter dan 200 urn. Hersenplakjes gesneden op 200 um bereik kan voldoende zijn om bepaalde types neuron welke op deze plakdikte bijvoorbeeld piramidale neuronen in ondiepe lagen van de hersenschors 10, 11, 12, piramidale neuronen in het CA1-gebied van het visualiseren hippocampus 13, 14 en granule cellen in de dentate gyrus van de hippocampus 15. Neuronen met relatief langeredendritische bomen, zoals piramidale neuronen in diepe lagen van de hersenschors die voor muizen kan meer dan 800 urn uitstrekken vanaf het cellichaam 16, verschaffen een grotere uitdaging omdat hersenen zou moeten worden doorgesneden op een perfecte hoek met de gehele dendriet structuur bevatten minder dan 200 urn plakjes. Dit kan zelfs onmogelijk zijn als een dendriet of een van de vertakkingen zich uitstrekken in de rostrale en caudale richting. Hoewel het mogelijk is om deze beperking aan te pakken door het traceren van een neuron over meerdere aangrenzende hersenen secties, deze aanpak introduceert een belangrijke technische uitdaging bij de aanpassing van de delen nauwkeurig voor het traceren van 17. Een meer praktische benadering zou zijn gehele neuronen opgenomen in hersensecties die een grotere dikte worden gesneden visualiseren.
Wij rapporteren hier een techniek om neuronen in 400 vlekken – 500 urn dikke hersenen secties van muizen met behulp van de Golgi-Cox methode, en hun mo visualiserenrphology behulp van een hoge-resolutie siliconenolie-immersie objectief dat een 800 pm werkafstand heeft. Het Golgi-Cox impregneren en verwerkingsprotocol we beschrijven is gemodificeerd van een van de meest geciteerde moderne protocollen in de literatuur 6. Onze aanpak dikke hersencoupes verschaft het voordeel van het verhogen van de waarschijnlijkheid van het identificeren neuronen van elke soort die volledig zijn vervat binnen de sectie. Naast de belangrijkste protocol, we ook twee varianten die unieke voordelen verschaffen: (1) Golgi-Cox kleuring met cresyl violet tegenkleuring op het oppervlak gemonteerde secties, teneinde grenzen van hersengebieden te definiëren en lagen van de identiteit cerebrale cortex, en (2) Golgi-Cox kleuring met een tussenproduct bevriezingsstap voor langetermijnopslag geïmpregneerd gehele hersenen vóór snijden en eindverwerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven hier een Golgi-Cox kleuringsprotocol met twee nuttige varianten voor het visualiseren van neuronen in hersenen dikke secties. Zoals getoond in de representatieve resultaten, het gebruik van een hoge-resolutie doelstelling met een lange werkafstand 800 pm heeft zorgt voor een betrouwbare weergave van gehele neuronen gehele diepte van hersensecties snijden bij 500 urn. Deze studie relatief dikke hersencoupes vermindert de waarschijnlijkheid dat gekleurde neuronen van elk type volledig binnen de slice, wat v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Discovery Grant CDCB van het Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada (NSERC), een John R. Evans Leaders Fund onderzoeksinfrastructuur subsidie aan CDCB uit Canada Stichting voor Innovatie (CFI projectnummer 30381), en door een Discovery Grant NJM van NSERC. ELL werd ondersteund door een Ontario Graduate Scholarship en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph. CDS werd ondersteund door een Undergraduate Student Research assistentschap van NSERC. ALM werd ondersteund door een Alexander Graham Bell Scholarship uit NSERC en door een OVC Scholarship van de Ontario Veterinary College van de Universiteit van Guelph.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. . From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
