Нейроны обработки изображений внутри толстых срезов мозга с помощью метода Гольджи-Кокса
Summary
Мы представляем протокол с использованием метода окрашивания Гольджи-Кокса в толстых участках мозга, для того, чтобы визуализировать нейроны с длинными дендритных деревьев, содержащихся в пробах отдельных тканей. Также представлены два варианта этого протокола, которые включают Cresyl фиолетовые контрастные и замораживание необработанных мозгов для длительного хранения.
Abstract
Метод Гольджи-Кокса нейронного окрашивания был использован в течение более чем двух сотен лет, чтобы продвинуть наше понимание морфологии нейронов в пределах гистологических образцов мозга. Несмотря на то, что является предпочтительным с практической точки зрения, чтобы подготовить участки мозга при наибольшей толщине возможно, для того, чтобы увеличить вероятность выявления окрашенных нейронов, которые полностью содержащихся в отдельных разделах, этот подход ограничен с технической точки зрения по рабочей дистанции высоких -magnification микроскопа цели. Мы сообщаем здесь протокол к окрашиванию нейронов с помощью метода Гольджи-Кокса в срезах мозга мышей, которые вырезаны при толщине 500 мкм, а для визуализации нейронов по всей глубине этих секций с использованием вертикального микроскопа, установленного с высокой разрешающей способностью 30X силикона 1,05 Н.А. цель масла погружения, который имеет рабочее расстояние 800 мкм. Мы также сообщаем два полезных варианта этого протокола, которые могут быть использованы для контрастной поверхностиустановлены срезы головного мозга с крезили Вайолет Ниссл пятно, или заморозить целые мозги для длительного хранения до секционирования и окончательной обработки. Основной протокол и его два варианты получение окрашенных толстых срезов головного мозга, в течение которого полные нейрон дендритных дерева и дендритные шипы могут быть надежно визуализироваться и количественно.
Introduction
Визуализация отдельных нейронов в образцах тканей позволяет на месте анализа нейронных морфологических характеристик, которые значительно продвинули наше понимание мозга и как это может быть под влиянием эндогенных заболеваний или экзогенных факторов окружающей среды. Метод окрашивания Гольджи-Кокса является экономически эффективными, относительно простых способами окрашивания случайной выборки нейронов в головном мозге. Во- первых , разработанный Гольджи 1 и модифицированной Коксом 2 в 1800 – х годах, исследователи доработан эту технику на протяжении многих лет , чтобы произвести четкие, хорошо окрашенные нейроны , которые могут быть использованы для визуализации и количественного определения как дендритной морфологии дерева и плотность позвоночника 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,
Основным техническим фактором для визуализации нейронов, окрашенных в срезах мозга максимальная толщина среза, которая ограничена рабочим расстоянием, имеющихся в наличии высокого увеличения / микрообъективов с высокой разрешающей способностью. Общие цели масло погружения в 60 – 100X диапазон обеспечивают превосходное разрешение, но ограничены их рабочими расстояниями, которые не являются, как правило, не более 200 мкм. Срезы мозга разрезать на мкм диапазона 200 могут быть достаточными , чтобы визуализировать определенные типы нейронов , которые могут содержаться в пределах этой толщины среза, например пирамидальных нейроны в неглубоких слоях коры головного мозга 10, 11, 12, пирамидальных нейронов в области СА1 из гиппокампа 13, 14 и зернистых клеток в зубчатой извилине гиппокампа 15. Нейроны с относительно болеедендритные дерева, такие как пирамидальные нейроны в пределах глубоких слоев коры головного мозга , что для мыши может продлить более 800 мкм от тела 16 клеток, обеспечивает большую проблему , потому что мозг должен были бы быть разрезали на идеальный угле , чтобы содержать все дендриты дерева в пределах 200 мкм ломтиков. Это может даже не быть возможным, если дендрит или любой из его ветвей проходят в ростральной или каудальном направлении. В то время как можно решить это ограничение путем отслеживания нейрона на нескольких соседних участках мозга, этот подход представляет существенную техническую проблему в точном выравнивании разделов для отслеживания 17. Более практичным подходом было бы визуализировать целые нейроны, содержащиеся в срезах головного мозга, которые разрезаются на большей толщины.
Мы сообщаем здесь технику, чтобы окрасить нейроны в пределах 400 – 500 мкм срезах мозга мышей с помощью метода Гольджи-Кокса, и визуализировать их моrphology использование кремния цели масла погружения с высоким разрешением, который имеет рабочее расстояние 800 мкм. Пропитки и обработки протокола Гольджи-Кокса , который мы описываем модифицирован из одной из самых цитируемых современных протоколов в литературе 6. Наш подход с толстыми срезами мозга обеспечивает преимущество увеличения вероятности идентификации нейронов любого типа, которые полностью входит в секции. В дополнении к основному протоколу, мы также присутствует два варианта, которые обеспечивают уникальные преимущества: (1) Гольджи-Кокса окрашивание с крезили фиолетовые контрастирующие на поверхности смонтированных участков, с тем чтобы определить границы областей головного мозга и определить слои кора головного мозга, и (2) Гольджи-Кокса окрашивание с промежуточной стадии замораживания для длительного хранения пропитанных весь мозг перед секционирования и окончательная обработка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем протокол Гольджи-Кокса окрашивания вместе с двумя вариантами полезными для визуализации нейронов в толстых срезах головного мозга. Как показано на Представитель Результатов, использование объектива с высоким разрешением, который имеет большое рабочее расстояние 800 м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Discovery Грант CDCB из естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC), лидеров фонда грант исследовательской инфраструктуры Джон Р. Эванс CDCB из Канады Фонд инноваций (CFI проект номер 30381), а также по открытие Грант NJM от NSERC. ELL была поддержана Стипендия Ontario Graduate и стипендию ВЗУ из Онтарио ветеринарного колледжа при Университете гвельфов. CDS была поддержана магистрант Research ассистентами из NSERC. ALM была поддержана Стипендия Александр Грэхем Белл из NSERC и в ВЗУ Scholarship из Онтарио ветеринарного колледжа при Университете гвельфов.
Materials
| potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
| potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
| mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
| Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
| isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
| 20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
| sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
| sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
| sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
| 50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
| agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
| small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
| mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
| paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
| ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
| Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
| superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
| anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
| cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
| permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| upright microscope | Olympus | BX53 model | |
| colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
| three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
| 4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
| 10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
| 30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
| 60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
| silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
| Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
| ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
| Photoshop software | Adobe | version CS6 |
References
- Golgi, C. Sulla struttura della sostanza grigia del cervello. Gazzetta Medica Italiana. Lombardia. 33, 244-246 (1873).
- Cox, W. H. Imprägnation des centralen Nervensystems mit Quecksilbersalzen. Archiv f. mikrosk. Anat. 37, 16-21 (1891).
- Zaqout, S., Kaindl, A. M. Golgi-Cox Staining Step by Step. Front Neuroanat. 10, 38 (2016).
- Levine, N. D., et al. Advances in thin tissue Golgi-Cox impregnation: fast, reliable methods for multi-assay analyses in rodent and non-human primate brain. J Neurosci Methods. 213 (2), 214-227 (2013).
- Ranjan, A., Mallick, B. N. A modified method for consistent and reliable Golgi-Cox staining in significantly reduced time. Front Neurosci. 1, 157 (2010).
- Gibb, R., Kolb, B. A method for vibratome sectioning of Golgi-Cox stained whole rat brain. J Neurosci Methods. 79 (1), 1-4 (1998).
- Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum. J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).
- Narayanan, S. N., et al. Appraisal of the effect of brain impregnation duration on neuronal staining and morphology in a modified Golgi-Cox method. J Neurosci Methods. 235, 193-207 (2014).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Sutherland, R., Gibb, R., Kolb, B. The hippocampus makes a significant contribution to experience-dependent neocortical plasticity. Behav Brain Res. 214 (1), 121-124 (2010).
- Hamilton, G. F., Whitcher, L. T., Klintsova, A. Y. Postnatal binge-like alcohol exposure decreases dendritic complexity while increasing the density of mature spines in mPFC Layer II/III pyramidal neurons. Synapse. 64 (2), 127-135 (2010).
- Nashed, M. G., Seidlitz, E. P., Frey, B. N., Singh, G. Depressive-like behaviours and decreased dendritic branching in the medial prefrontal cortex of mice with tumors: A novel validated model of cancer-induced depression. Behav Brain Res. 294, 25-35 (2015).
- Frauenknecht, K., et al. Mice with experimental antiphospholipid syndrome display hippocampal dysfunction and a reduction of dendritic complexity in hippocampal CA1 neurones. Neuropathol Appl Neurobiol. 41 (5), 657-671 (2015).
- Camacho-Abrego, I., et al. Rearrangement of the dendritic morphology of the neurons from prefrontal cortex and hippocampus after subthalamic lesion in Sprague-Dawley rats. Synapse. 68 (3), 114-126 (2014).
- Redila, V. A., Christie, B. R. Exercise-induced changes in dendritic structure and complexity in the adult hippocampal dentate gyrus. Neuroscience. 137 (4), 1299-1307 (2006).
- Bailey, C. D., Alves, N. C., Nashmi, R., De Biasi, M., Lambe, E. K. Nicotinic alpha5 subunits drive developmental changes in the activation and morphology of prefrontal cortex layer VI neurons. Biol Psychiatry. 71 (2), 120-128 (2012).
- Lytton, W. W. . From computer to brain : foundations of computational neuroscience. , (2002).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Ha, H. A modified Golgi-Cox method with counterstain for the study of synapses. Anat Rec. 155 (1), 59-64 (1966).
- Swanson, L. W. The locus coeruleus: a cytoarchitectonic, Golgi and immunohistochemical study in the albino rat. Brain Res. 110 (1), 39-56 (1976).
- Pilati, N., Barker, M., Panteleimonitis, S., Donga, R., Hamann, M. A rapid method combining Golgi and Nissl staining to study neuronal morphology and cytoarchitecture. J Histochem Cytochem. 56 (6), 539-550 (2008).
