Imaging Nerveceller innenfor Tykke hjernesnitt Bruke Golgi-Cox Method

Summary

Vi presenterer en protokoll for anvendelse av Golgi-Cox fargingsmetode i tykke hjernesnitt, for å synlig nevroner med lange dendrittiske trær som inneholdes i enkelt vevsprøver. To varianter av denne protokollen er også presentert som involverer kresylfiolett motfarging, og frysing av ubehandlede hjerner for langtidslagring.

Abstract

Golgi-Cox metode for nevron farging har vært ansatt i mer enn to hundre år å fremme vår forståelse av neuron morfologi innen histologiske hjerneprøver. Mens det er foretrukket ut fra et praktisk perspektiv for å fremstille hjernesnitt ved den største tykkelsen mulig, for å øke sannsynligheten for å identifisere fargede neuroner som er fullt ut inneholdt i enkeltseksjoner, er begrenset fra et teknisk perspektiv av arbeidsavstanden av høy denne tilnærmingen -magnification mikroskop mål. Vi rapporterer her en protokoll for å farge neuroner ved hjelp av Golgi-Cox metode i musehjernesnitt som er kappet i 500 um tykkelse, og for å visualisere nevroner gjennom hele dybden av disse deler ved hjelp av en opprettstående mikroskop utstyrt med et høy-oppløsning 30X 1,05 NA silikon olje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Vi rapporterer også to nyttige varianter av denne protokoll som kan anvendes for å motfarge overflatenmontert hjernesnitt med cresylfiolett Nissl beis, eller for å fryse Hjernene i hel form for lengre tids lagring før seksjonering og endelig behandling. Hoved protokoll og de to variantene fremstille fargede tykke hjernesnitt, gjennom hvilken komp neuron dendrittiske trær og dendritt pigger kan bli pålitelig visualisert og kvantifisert.

Introduction

Visualiseringen av individuelle nevroner i vevsprøver tillater in-situ analyse av nevroner morfologiske egenskaper, som i betydelig grad har avansert vår forståelse av hjernen og hvordan den kan bli påvirket av endogene sykdom eller eksogene miljøfaktorer. Golgi-Cox fargingsmetode er en kostnadseffektiv, forholdsvis enkelt middel for farging av et tilfeldig utvalg av nevronene i hjernen. Først utviklet av Golgi ¹ og modifisert av Cox ² i 1800, har forskere videreutviklet denne teknikken i løpet av årene for å fremstille klare og fargede neuroner som kan brukes til å visualisere og kvantifisere begge dendrittisk tre morfologi og ryggrad tetthet ^{3, 4, 5, 6, 7, 8, 9}.

En vesentlig teknisk betraktning for visualisering av fargede neuroner i hjernesnitt er den maksimale skivetykkelse, som er begrenset av arbeidsavstand på tilgjengelige høy forstørrelse / høyoppløselige mikroskop mål. Vanlige olje-neddykking målene i 60 – 100 X avstand gir god oppløsning, men er begrenset av deres arbeids avstander som er typisk ikke større enn 200 um. Hjerne deler som er skåret på 200 pm området kan være tilstrekkelig for å visualisere visse neuron typer som kan finnes i denne skivetykkelse, f.eks pyramidale neuroner i grunne lag av hjernebarken ^{10, 11, 12,} pyramidale neuroner i CA1-regionen av hippocampus ^{13, 14} og granulceller i gyrus dentatus av hippocampus ^15. Nerveceller med relativt lengredendrittiske trær, slik som pyramidale neuroner innenfor dype lag av hjernebarken som for mus kan strekke seg mer enn 800 um fra cellelegemet ^16, gir en større utfordring fordi hjernen må være i snitt ved en perfekt vinkel for å inneholde hele dendritt treet mindre enn 200 um skiver. Dette kan ikke selv være gjennomførbart om en dendritt eller en hvilken som helst av dens grener strekker seg i den rostrale eller caudal retning. Selv om det er mulig å løse denne begrensningen ved å spore en neuron i flere tilstøtende hjernesnitt, innfører denne tilnærmingen en betydelig teknisk utfordring i å innrette delene nøyaktig for sporing ^17. En mer praktisk tilnærming ville være å visualisere hele nerveceller som finnes i hjernesnitt som er skåret i en større tykkelse.

Vi rapporterer her en teknikk for å sette flekker neuroner i løpet av fra 400 – 500 um tykke hjernesnitt for mus ved hjelp av Golgi-Cox-metoden, og å visualisere deres morphology ved hjelp av et høyoppløselig silikonolje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Golgi-Cox impregnering og behandling protokoll som vi beskriver er modifisert fra en av de ovenfor siterte moderne protokoller i litteraturen ^6. Vår tilnærming med tykke hjernesnitt gir den fordel av å øke sannsynligheten for å identifisere neuroner av enhver type som er fullt ut inneholdt i seksjonen. I tillegg til hovedprotokollen, vi også presentere to varianter som gir unike fordeler: (1) Golgi-Cox farging med cresylfiolett motfarge på overflaten av monterte seksjoner, for å definere grensene for hjerneregionene og for å identifisere lag av cerebral cortex, og (2) Golgi-Cox farging med et mellomliggende frysetrinn for langtidslagring av impregnerte hjernene før seksjonering og endelig behandling.

Protocol

Voksne hunn CD1-stamme mus ble anvendt i denne studien. Lignende flekker kan oppnås ved hjelp av begge kjønn i ulike aldre. Forsøksdyr var ivaretatt i henhold til de prinsipper og retningslinjer for den kanadiske Council on Animal Care, og den eksperimentelle protokollen ble godkjent av University of Guelph Animal Care Committee. 1. Golgi-Cox Beising Golgi-Cox Impregnering av Brains Gjør Golgi-Cox oppløsning av 1% (w / v) kaliumdikromat, 0,8% (w / v)…

Representative Results

Dette Golgi-Cox farging protokoll og de to beskrevne valgfrie varianter kan anvendes for å visualisere individuelle neuroner i løpet av 400 – 500 um tykke hjernesnitt. Representative bilde montasjer av to-dimensjonale Z-fremspring tatt ved hjelp av et 10X objektiv og 5 um trinn i Z-aksen er vist i figur 1: A1 – C1 for et stort område av koronale hjernesnitt som innbefatter fremre cingulate cortex område 1 og den sekundær motor cortex 18. Snit…

Discussion

Vi beskriver her en Golgi-Cox farging protokoll sammen med to nyttige varianter for visualisering av neuroner i løpet av tykke hjernesnitt. Som vist i de representative resultater, gav bruken av en høy-oppløsning objektiv som har en lang 800 um arbeidsavstand gjør det mulig å pålitelig visualisering av hele neuroner i hele dybden av hjerne deler som er skåret på 500 pm. Denne studien av forholdsvis tykke hjernesnitt øker sannsynligheten for at farget neuroner fra en hvilken som helst type er fullt ut inneholdt …

Materials

potassium dichromate	Fisher Scientific	P188-100	Hazardous
potassium chromate	Fisher Scientific	P220-100	Hazardous
mercuric chloride	Fisher Scientific	S25423	Hazardous
Whatman grade 1 filter paper	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Pharmaceutical Partners of Canada	CP0406V2
20 mL scintillation vial	Fisher Scientific	03-337-4
sucrose	Bioshop Canada	SUC700.1
sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	S5011-500G
sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	S9390-500G
50 mL conical tube	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	also known as 2-methylbutane. Hazardous
agar	Sigma Aldrich	A1296-100G
small weigh dish	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S
6 well tissue culture plates	Fisher Scientific	08-772-1b
mesh bottom tissue culture inserts	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde, 16%	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hazardous
ammonium hydroxide	Fisher Scientific	A669S-500	Hazardous
Kodak Fixative A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
CitroSolv clearing agent	Fisher Scientific	22-143-975
anhydrous ethyl alcohol	Commercial Alcohols	N/A
cresyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
upright microscope	Olympus	BX53 model
colour camera, 12 bit	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders	MBF Biosciences	N/A	Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences
4x microscope objective	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10x microscope objective	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30x microscope objective	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo
60x microscope objective	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
silicone immersion oil	Olympus	Z-81114
Neurolucida software	MBF Biosciences	Version 10
ImageJ software	U. S. National Institutes of Health	Current version	With the OME Bio-Formats plugin installed
Photoshop software	Adobe	version CS6