Vi presenterer en protokoll for anvendelse av Golgi-Cox fargingsmetode i tykke hjernesnitt, for å synlig nevroner med lange dendrittiske trær som inneholdes i enkelt vevsprøver. To varianter av denne protokollen er også presentert som involverer kresylfiolett motfarging, og frysing av ubehandlede hjerner for langtidslagring.
Golgi-Cox metode for nevron farging har vært ansatt i mer enn to hundre år å fremme vår forståelse av neuron morfologi innen histologiske hjerneprøver. Mens det er foretrukket ut fra et praktisk perspektiv for å fremstille hjernesnitt ved den største tykkelsen mulig, for å øke sannsynligheten for å identifisere fargede neuroner som er fullt ut inneholdt i enkeltseksjoner, er begrenset fra et teknisk perspektiv av arbeidsavstanden av høy denne tilnærmingen -magnification mikroskop mål. Vi rapporterer her en protokoll for å farge neuroner ved hjelp av Golgi-Cox metode i musehjernesnitt som er kappet i 500 um tykkelse, og for å visualisere nevroner gjennom hele dybden av disse deler ved hjelp av en opprettstående mikroskop utstyrt med et høy-oppløsning 30X 1,05 NA silikon olje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Vi rapporterer også to nyttige varianter av denne protokoll som kan anvendes for å motfarge overflatenmontert hjernesnitt med cresylfiolett Nissl beis, eller for å fryse Hjernene i hel form for lengre tids lagring før seksjonering og endelig behandling. Hoved protokoll og de to variantene fremstille fargede tykke hjernesnitt, gjennom hvilken komp neuron dendrittiske trær og dendritt pigger kan bli pålitelig visualisert og kvantifisert.
Visualiseringen av individuelle nevroner i vevsprøver tillater in-situ analyse av nevroner morfologiske egenskaper, som i betydelig grad har avansert vår forståelse av hjernen og hvordan den kan bli påvirket av endogene sykdom eller eksogene miljøfaktorer. Golgi-Cox fargingsmetode er en kostnadseffektiv, forholdsvis enkelt middel for farging av et tilfeldig utvalg av nevronene i hjernen. Først utviklet av Golgi 1 og modifisert av Cox 2 i 1800, har forskere videreutviklet denne teknikken i løpet av årene for å fremstille klare og fargede neuroner som kan brukes til å visualisere og kvantifisere begge dendrittisk tre morfologi og ryggrad tetthet 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9.
En vesentlig teknisk betraktning for visualisering av fargede neuroner i hjernesnitt er den maksimale skivetykkelse, som er begrenset av arbeidsavstand på tilgjengelige høy forstørrelse / høyoppløselige mikroskop mål. Vanlige olje-neddykking målene i 60 – 100 X avstand gir god oppløsning, men er begrenset av deres arbeids avstander som er typisk ikke større enn 200 um. Hjerne deler som er skåret på 200 pm området kan være tilstrekkelig for å visualisere visse neuron typer som kan finnes i denne skivetykkelse, f.eks pyramidale neuroner i grunne lag av hjernebarken 10, 11, 12, pyramidale neuroner i CA1-regionen av hippocampus 13, 14 og granulceller i gyrus dentatus av hippocampus 15. Nerveceller med relativt lengredendrittiske trær, slik som pyramidale neuroner innenfor dype lag av hjernebarken som for mus kan strekke seg mer enn 800 um fra cellelegemet 16, gir en større utfordring fordi hjernen må være i snitt ved en perfekt vinkel for å inneholde hele dendritt treet mindre enn 200 um skiver. Dette kan ikke selv være gjennomførbart om en dendritt eller en hvilken som helst av dens grener strekker seg i den rostrale eller caudal retning. Selv om det er mulig å løse denne begrensningen ved å spore en neuron i flere tilstøtende hjernesnitt, innfører denne tilnærmingen en betydelig teknisk utfordring i å innrette delene nøyaktig for sporing 17. En mer praktisk tilnærming ville være å visualisere hele nerveceller som finnes i hjernesnitt som er skåret i en større tykkelse.
Vi rapporterer her en teknikk for å sette flekker neuroner i løpet av fra 400 – 500 um tykke hjernesnitt for mus ved hjelp av Golgi-Cox-metoden, og å visualisere deres morphology ved hjelp av et høyoppløselig silikonolje-neddykking objektiv som har en 800 um arbeidsavstand. Golgi-Cox impregnering og behandling protokoll som vi beskriver er modifisert fra en av de ovenfor siterte moderne protokoller i litteraturen 6. Vår tilnærming med tykke hjernesnitt gir den fordel av å øke sannsynligheten for å identifisere neuroner av enhver type som er fullt ut inneholdt i seksjonen. I tillegg til hovedprotokollen, vi også presentere to varianter som gir unike fordeler: (1) Golgi-Cox farging med cresylfiolett motfarge på overflaten av monterte seksjoner, for å definere grensene for hjerneregionene og for å identifisere lag av cerebral cortex, og (2) Golgi-Cox farging med et mellomliggende frysetrinn for langtidslagring av impregnerte hjernene før seksjonering og endelig behandling.
Vi beskriver her en Golgi-Cox farging protokoll sammen med to nyttige varianter for visualisering av neuroner i løpet av tykke hjernesnitt. Som vist i de representative resultater, gav bruken av en høy-oppløsning objektiv som har en lang 800 um arbeidsavstand gjør det mulig å pålitelig visualisering av hele neuroner i hele dybden av hjerne deler som er skåret på 500 pm. Denne studien av forholdsvis tykke hjernesnitt øker sannsynligheten for at farget neuroner fra en hvilken som helst type er fullt ut inneholdt …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en Discovery Grant til CDCB fra naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (NSERC), en John R. Evans Leaders Fund forskningsinfrastruktur tilskudd til CDCB fra Canada Foundation for innovasjon (CFI prosjektnummer 30381), og ved å en Discovery Grant til NJM fra NSERC. ELL ble støttet av en Ontario Graduate Scholarship og ved en OVC stipend fra Ontario Veterinary College ved University of Guelph. CDS ble støttet av en Undergraduate Student Forskning assistant fra NSERC. ALM ble støttet av en Alexander Graham Bell Stipend fra NSERC og ved en OVC stipend fra Ontario Veterinary College ved University of Guelph.
potassium dichromate | Fisher Scientific | P188-100 | Hazardous |
potassium chromate | Fisher Scientific | P220-100 | Hazardous |
mercuric chloride | Fisher Scientific | S25423 | Hazardous |
Whatman grade 1 filter paper | Fisher Scientific | 1001-185 | |
isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | CP0406V2 | |
20 mL scintillation vial | Fisher Scientific | 03-337-4 | |
sucrose | Bioshop Canada | SUC700.1 | |
sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S5011-500G | |
sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9390-500G | |
50 mL conical tube | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
isopentane | Fisher Scientific | AC126470010 | also known as 2-methylbutane. Hazardous |
agar | Sigma Aldrich | A1296-100G | |
small weigh dish | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
vibratome | Leica | VT1000 S | |
6 well tissue culture plates | Fisher Scientific | 08-772-1b | |
mesh bottom tissue culture inserts | Fisher Scientific | 07-200-214 | |
paraformadelhyde, 16% | Electron Microscope Sciences | 15710-S | Hazardous |
ammonium hydroxide | Fisher Scientific | A669S-500 | Hazardous |
Kodak Fixative A | Sigma Aldrich | P7542 | |
superfrost plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
CitroSolv clearing agent | Fisher Scientific | 22-143-975 | |
anhydrous ethyl alcohol | Commercial Alcohols | N/A | |
cresyl violet | Sigma Aldrich | C1791 | |
permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
upright microscope | Olympus | BX53 model | |
colour camera, 12 bit | MBF Biosciences | DV-47d | QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12 |
three-dimensional motorized microscope stage, controller and enoders | MBF Biosciences | N/A | Supplied and integrated with microscope by MBF Biosciences |
4x microscope objective | Olympus | 4x 0.16 N.A. UplanSApo | |
10x microscope objective | Olympus | 10x 0.3 N.A. UPlan FL N | |
30x microscope objective | Olympus | 30x 1.05 N.A. UPlanSApo | |
60x microscope objective | Olympus | 60x 1.42 N.A. PlanAPO N | |
silicone immersion oil | Olympus | Z-81114 | |
Neurolucida software | MBF Biosciences | Version 10 | |
ImageJ software | U. S. National Institutes of Health | Current version | With the OME Bio-Formats plugin installed |
Photoshop software | Adobe | version CS6 |