Rapide et raffiné CD11b Isolation magnétique de primaire microglies avec pureté améliorée et polyvalence
Summary
Nous présentons ici un protocole pour isoler microglies de souriceaux post – natal (jour 1) pour l' expérimentation in vitro. Cette méthode d'isolement improvisée génère à la fois un rendement et une pureté élevés, un avantage significatif par rapport aux méthodes de remplacement qui permet une expérimentation à large gamme pour les besoins de l'élucidation de la biologie de la microglie.
Abstract
Les microglies sont les répondeurs principaux aux insultes du système nerveux central; Cependant, il reste encore beaucoup de leur rôle dans la régulation neuro-inflammation. Microglies sont des cellules mésodermiques qui fonctionnent de manière similaire aux macrophages dans le stress inflammatoire arpentage. Le classique (M1-type) et alternatif (M2 type) activations de macrophages ont également été étendues à microglie dans le but de mieux comprendre l'interaction sous-jacente de ces phénotypes ont dans des conditions neuro-inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, d'Alzheimer et la maladie de Huntington. Dans l' expérimentation in vitro en utilisant la microglie primaire offre des résultats rapides et fiables qui peuvent être étendues à l'environnement in vivo. Bien que ce soit un net avantage sur l' expérimentation in vivo, l' isolement microglies tout en obtenant des rendements adéquats de pureté optimale a été un défi. Les méthodes courantes actuellement utilisées souffrent soit de faible récupération, de faible pureté, ou les deux. Ici, nous demontrer un perfectionnement du procédé de séparation magnétique CD11b sans colonne qui permet d'obtenir une récupération élevée de cellules et de pureté améliorée dans la moitié de la quantité de temps. Nous vous proposons cette méthode optimisée comme un modèle très utile d'isolement microglie primaire aux fins de l'étude et la neuro-inflammation neurodégénérescence.
Introduction
Les microglies sont macrophages résidents Myb indépendants d'origine mésodermique, qui se différencient à partir de c-kit + / CD45- érythromyéloïde progéniteurs dans les îlots sanguins de la vésicule ombilicale 1, 2. Une fois embryologique microglie ont colonisé le système nerveux central (SNC), leur transition d'une amoeboid à une forme ramifiée 3. Ces microglies adultes sont classés comme Surveillant puisque leurs ramifications dynamiques sonde le parenchyme cérébral sain pour les insultes potentiels 4. Bien que les microglies ne contribuent à environ 10% de la population de cellules du système nerveux central, leur capacité à carreaux entre l'autre assure la numérisation maximale du parenchyme 4, 5. Motifs moléculaires associés danger (DAMPS), tels que α-synucléine 6, 7 et 8 β-amyloïde, ou pmotifs moléculaires associés athogen (PAMP) tels que le lipopolysaccharide (LPS) 9, classiquement activer la microglie , de promouvoir une réaction inflammatoire caractérisée par le retour à l'état actif de amoeboid et la production d'oxyde nitrique, le facteur-α de nécrose tumorale (TNF), l' interleukine 1β (IL-1β), IL-6, IL-12, et le ligand motif chimiokine CC 2 9, 10, 11. Dans des conditions neuro – inflammatoires telles que la maladie de Parkinson, dans laquelle pathogène α-synucléine a accumulé, un cycle neurodégénérative est créé à partir de la mort des neurones dopaminergiques, qui libèrent α-synucléine agrégée plus, en favorisant en outre l' activation de la microglie classique 7. Similaires aux macrophages périphériques, la microglie peut également avoir la capacité d'activer alternativement en présence des cytokines anti-inflammatoires IL-4 et IL-10, en leur donnant la puissanteial de favoriser la réparation neuronale et l' inflammation 2 atténuer, 11. En plus de leurs rôles immunologiques dans le système nerveux central, la microglie ont été décrits en tant que régulateurs vitaux des circuits neuronaux par la taille synapses au cours du développement. Par exemple, les souris KO ont Cx3cr1- microglie moins denses et réduit la taille synaptique, ce qui conduit à une surabondance d'épines dendritiques immatures, synapses, et les motifs électrophysiologiques d'une sous – développée du système nerveux central 12. La compréhension de ces complexités physiologiques et les divers rôles fonctionnels des microglies dans l'homéostasie du système nerveux central est essentiel à la recherche de thérapies ciblant les maladies neurodégénératives.
Dans le domaine de la neuro – immunologie, des expériences in vitro sont hautement souhaitables en raison de la plus grande faisabilité des études mécanistes, les coûts d'entretien et d'être moins de temps et de main-d'œuvre. Furthermore, la capacité d'isoler des populations de cellules est essentielle pour délimiter la fonctionnalité de ces cellules cibles dans des conditions prescrites. De nombreuses méthodes d'isolement microgliales existent, mais ils sont limités par leur capacité à obtenir un nombre relativement élevé et la pureté pour une large expérimentation 13, 14, 15. Par exemple, un groupe d'11b de différenciation (CD11b) est un marqueur de surface commune des monocytes, les macrophages et les microglies 16. En exploitant CD11b, un procédé de séparation magnétique a d' abord été décrit comme étant une approche basée sur colonne qui a donné ~ pureté de 99,5% et ~ 1,6 x 10 6 par la microglie cerveau néonatal 17. Notre laboratoire a récemment mis au point un procédé de séparation magnétique CD11b libre de la colonne 15, que nous avons effectuée dans un tube de polystyrène par le marquage CD11b avec un anticorps monoclonal conjugué à la phycoérythrine (PE). Un bispécifique secondary anticorps à PE et complexes dextrane avec le PE. Une fois lié, les particules magnétiques revêtues de dextrane sont introduits, qui se lient à la fin de dextrane du complexe d'anticorps. Enfin, le tube en polystyrène est placé dans un aimant pour l'isolement de la microglie. Cette approche a doublé le rendement à ~ 3,2 x 10 6 microglies par cerveau du nouveau – né , mais au coût de la réduction à la pureté ~ 97%.
Ici, nous démontrons un protocole magnétique CD11b sans colonne rapide et raffinée séparation (figure 1). Cette méthode améliorée reste aussi possible que notre méthode sans colonne d'origine puisque le prix du kit de séparation magnétique CD11b est le même. La durée de traitement est réduit de moitié, ce qui peut être crucial pour optimiser le rendement et la survie cellulaire. En particulier, la pureté obtenue à partir de cette méthode optimisée est ~> 99%, une nette amélioration par rapport à la pureté obtenue à partir de la méthode sans colonne originale développée par notre laboratoire 15. Plus important encore, CD11b-PEn'est pas utilisé, ce qui élimine la nécessité de laisser incuber abri de la lumière et permettant l'utilisation du canal rouge pour la microscopie de fluorescence. Enfin, comme dans le procédé CD11b original, une fraction astrocytaire de rendement élevé et une pureté est obtenue avec ce procédé amélioré. Les astrocytes sont les plus nombreuses cellules gliales du système nerveux central, ce qui conduit à l'idée que leurs fonctions sont indispensables homéostatique par rapport à 18 physiopathologie. Ces cellules gliales jouent un rôle dans diverses fonctions physiologiques telles que la formation de la barrière hémato-encéphalique, fournissant un soutien en éléments nutritifs, le maintien de l'homéostasie des neurotransmetteurs, formant des cicatrices gliales en réponse à des blessures, la neuroprotection, l'apprentissage et la mémoire, et neuroinflammation, ce qui illustre leur potentiel d'enquête dans gliale biologie 19. Morphologique et la fonctionnalité de la microglie et astrocytes ont été vérifiés par microscopie confocale, Western Blot quantitative en temps réel Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR), Gdosage de nitrite Riess, et le dosage des cytokines multiplex Luminex. Le raffinement fourni par ce protocole offre une plus grande confiance concernant la pureté des microglies ou astrocytes, une application plus large de la microscopie à fluorescence avec la disponibilité du canal rouge, et fait gagner du temps, qui sont tous importants pour l' expérimentation in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anciennes méthodes d'isolement microgliales ont des recouvrements limités qui ne sont pas appropriés pour diverses analyses de protéines par Western Blot et des analyses ARN par qRT-PCR. L'adhérence différentielle et les méthodes de trypsinisation douces sont deux approches courantes avec de faibles rendements microgliales 13, 14, 15. L'approche basée CD11b colonne de récupération est également faible, ma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (NIH): le nom de subventions NS088206 et ES026892. W. Eugene et Linda Lloyd président à Doué AGK et les doyens Professorat à AK sont également reconnues.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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