Geliştirilmiş Saflık ve Çok Yönlü İlköğretim mikroglia hızlı ve Rafine CD11 Manyetik İzolasyon
Summary
Burada, in vitro deneyler için doğum sonrası fare yavrularından mikroglia izole etmek için bir protokol (gün 1) sunulmuştur. izolasyon Bu doğaçlama yöntem hem de yüksek verim ve saflıkta, mikroglial biyoloji açıklık amacıyla geniş bir aralık deney sağlar alternatif yöntemler üzerinde önemli bir avantaj oluşturur.
Abstract
Mikroglia merkezi sinir sistemi sıvı ataklarında birincil yanıt olarak; Ancak çok nöro-inflamasyonu düzenleyen rolleri hakkında bilinmiyor. Mikroglia inflamatuar stresi ölçme makrofajlar benzer şekilde işlev mezodermal hücrelerdir. Klasik (M1-tipi) ve alternatif (M2-tipi) makrofajlar aktivasyonlar da daha iyi bu fenotipleri böyle Parkinson, Alzheimer ve Huntington Hastalıkları gibi nöro koşullarda sahip altta yatan etkileşimi anlamak için bir çaba mikroglia uzatılmıştır. In vitro deney in vivo ortama uzatılabilir hızlı ve güvenilir sonuçlar birincil mikroglia sunmaktadır kullanılarak. Bu sorun olmuştur uygun saflıkta yeterli verimler elde ederken mikroglia izole in vivo deney üzerinde açık bir avantaj olmasına rağmen. Şu anda kullanımda olan Sık kullanılan yöntemler ya düşük kurtarma, düşük saflık veya her ikisi muzdarip. Bu yazıda, demlenmeyesürenin yarısı miktarda yüksek hücre kurtarma ve gelişmiş saflıkta elde kolonsuz CD11 manyetik ayırma yönteminin bir arıtma onstrate. Biz nöro-inflamasyonu ve nörodejenerasyonu okuyan amacıyla ana mikroglial izolasyonun son derece yararlı bir model olarak bu duruma getirilmiş yöntem önerilmektedir.
Introduction
Mikroglia c-kit + / CD45- ayırt mezodermal kökenli myb bağımsız yerleşik makrofajlar yolk kesesi 1, 2, kan Adaları progenitörleri erythromyeloid bulunmaktadır. Embriyolojik mikroglia merkezi sinir sistemini (CNS) kolonileştiklerinde, bir dallanmış formda 3'e bir amoeboid geçiş. Dinamik yansımaları potansiyel hakaretler 4 için sağlıklı beyin parankimi soruşturma beri Bunlar yetişkin mikroglia surveillant olarak sınıflandırılır. Mikroglia sadece MSS hücre nüfusunun yaklaşık% 10'una katkıda rağmen, kendi aralarında döşemek için yetenekleri parankimindeki 4, 5 maksimal tarama sağlar. Örneğin α-sinüklein 6, 7 ve amiloid-P 8 ya da p tehlikesi ile bağlantılı moleküler yapılar (DAMPS),lipopolisakarid (LPS) ile 9 olarak athogen ilişkili moleküler yapılar (PAMP), klasik amoeboid etkin duruma reversiyon ve nitrik oksit üretimi, tümör nekroz faktörü-α (TNFa), interlökin 1β ile vasıflandırılan enflamatuar bir tepki teşvik etmek mikroglia aktive (IL-1β), IL-6, IL-12 ve kemokin CC motifi ligandı 2 9, 10, 11. Patojenik α-sinüklein birikmiş olan Parkinson hastalığı gibi nöro koşullarında, bir nörodejeneratif döngüsü ayrıca mikroglia 7 klasik aktivasyonunu teşvik, daha birleşik α-sinükleinin serbest dopaminerjik nöronların ölümden oluşturulur. periferal makrofajlar benzer şekilde, mikroglia da alternatif olarak, anti-enflamatuar sitokinlerin IL-4 ve IL-10 varlığında aktive etme yeteneğine sahip onları etkili verecek şekilde olabiliriltihap 2, 11 sinir tamirinin geliştirilmesi ve hafifletme ial. Kenara CNS'de immünolojik rolleri, mikroglia gelişim sırasında sinaps budama nöronal devrenin hayati düzenleyicileri olarak tarif edilmiştir. Örneğin, Cx3cr1- KO fareleri, daha az yoğun mikroglia ve dendritik dikenler, olgunlaşmamış sinaps ve gelişmemiş bir CNS 12 elektrofizyolojik desen bir çok artışına neden düşük sinaptik budama sahiptir. CNS homeostazında bu fizyolojik karmaşıklığını ve mikroglia farklı işlevsel roller anlama nörodejeneratif bozuklukların hedefleyen terapötikler araştırılmasında için çok önemlidir.
Nöroimmünoloji alanında, in vitro deneyler için mekanik çalışmalar için daha fizibilite yüksek ölçüde istenebilecektir, düşük bakım maliyeti, daha az zaman ve emek-yoğun olduğu için. Furthermoyeniden hücre popülasyonlarının izole edilmesi yeteneği öngörülen koşullar altında, bu hedef hücrelerin işlevini tarif etmek önemlidir. Çok sayıda mikrogliyal izolasyon yöntemleri mevcuttur, ancak bunlar geniş bir deney 13, 14, 15 için nispeten yüksek bir sayı ve saflık elde etme kabiliyetleri ile sınırlıdır. Örneğin, farklılaşma 11b, bir küme (CD11), monositler, makrofajlar, ve mikroglia 16 ortak bir yüzey markörüdür. CD11b yararlanarak, manyetik ayırma, bir yöntem, ilk olarak neonatal beyin 17 başına bir sütun tabanlı vermiştir yaklaşım ~% 99.5 saflık ve ~ 1.6 x 10 6 mikroglia olarak tarif edilmiştir. Laboratuvar son zamanlarda fikoerıtrinle konjüge edilmiş bir monoklonal antikor (PE) CD11b etiketleyerek bir polistiren tüp içinde gerçekleştirilen bir kolonsuz CD11 manyetik ayırma yöntemi 15, geliştirdi. Bir bispesifik secondary antikor PE ve PE ile dekstran kompleksleri. Bir kez bağlanmış, dekstran-kaplı manyetik parçacıklar antikor kompleksinin dekstran ucuna bağlama yapan, tanıtılmaktadır. Son olarak, polistiren tüp mikroglial izolasyonu için bir mıknatıs yerleştirilir. Bu yaklaşım için verim iki ~ neonatal beyin başına ancak ~% 97 saflıkta azaltılması pahasına 3.2 x 10 6 mikroglia.
Burada, hızlı ve rafine kolonsuz CD11 manyetik ayırma protokolü (Şekil 1) göstermektedir. CD 11 b manyetik ayırma kiti fiyatı aynı olduğu için bu iyileştirilmiş yöntem orijinal kolonsuz metodu kadar hala mümkün. tamamlanma süresi, hücre hayatta kalması ve verimi maksimize etmek önemli olabilir yarısında, azaltılır. Özellikle, bu optimize yöntemden elde saflık ~>% 99, laboratuvarımızda 15 tarafından geliştirilen özgün kolonsuz yönteminden elde saflık üzerinde belirgin bir düzelme sağlanır. En önemlisi, CD11-PEIşıktan uzak kuluçkaya ihtiyacını ortadan kaldırarak ve floresan mikroskobu için kırmızı kanalının kullanımına izin veren, kullanılmaz. Son olarak, orijinal CD11b yönteminde olduğu gibi, yüksek verim ve saflıkta bir astrositik fraksiyonu, bu geliştirilmiş bir yöntem ile elde edilir. Astrositler onların homeostatik fonksiyonları patofizyolojisi 18 göre vazgeçilmezdir fikrine yol açan, CNS içinde en çok glial hücrelerdir. Bu glial hücreler, glial kendi soruşturma potansiyel örneklendiren, besin desteği sağlayan, kan-beyin bariyeri oluşturan nörotransmiter homeostazın korunması hasarı, nöro-yanıt glial yara izi oluşturma, öğrenme ve hafıza, ve Nöro gibi çeşitli fizyolojik fonksiyonlarında önemli bir rol oynar biyoloji 19. Morfoloji ve mikroglia ve astrositlerin işlevselliği konfokal mikroskopi, Western kurutma nicel Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (QRT PCR), G aracılığıyla tespit edilmiştirRiess nitrit deneyi, ve Luminex multipleks sitokin deneyi. Bu protokolü tarafından sağlanan arıtma in vitro deneyler için önemli olan, tüm bunların mıkroglıal veya astrositik saflık, kırmızı kanalın kullanılabilirliği ile floresan mikroskobu geniş uygulamasına ilişkin güveni arttı ve zaman tasarrufu sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eski mikroglial izolasyon yöntemleri, çeşitli protein Western blot analizleri ve RNA QRT-PCR ile analiz için uygun değildir sınırlı geri kazanımları sahiptir. Diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon yöntemler düşük mikroglial verim 13, 14, 15 sahip iki genel yaklaşım vardır. Sütun tabanlı CD11b yaklaşım aynı zamanda düşük bir iyileşme, ancak diferansiyel yapışma ve hafif tripsinizasyon <sup cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206 ve ES026892: Bu çalışma Sağlık (NIH) Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleriyle desteklenmiştir. W. Eugene ve Linda Lloyd bahşedilmiş Sandalye AGK ve AK Dekanlar Profesörlük da kabul edilmektedir.
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
References
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
- Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
- Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson’s disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
- Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson’s disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
- Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84 (2011).
- Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson’s Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
- Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson’s Disease: Foe and ally?. Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
- Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
- Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
- Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
- Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma, ., J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
- Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
- Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
- Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson’s disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
- Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).
