強化された純度と汎用性を持つ初代ミクログリアの迅速かつ洗練されたCD11b磁気分離
Summary
ここでは、in vitroの実験のために出生後の仔マウス（1日目）からミクログリアを分離するためのプロトコルを提示します。分離のこの即興方法は、高収率および高純度、ミクログリア生物学を解明する目的で、広範囲の実験を可能にする別の方法を超える有意な利点の両方を生成します。
Abstract
ミクログリアは、中枢神経系傷害への一次対応者です。しかし、多くの神経炎症の調節におけるその役割については不明のまま。ミクログリアは、炎症性ストレスを調査中で、マクロファージと同様に機能する中胚葉細胞です。古典（M1型）および代替（M2型）マクロファージの活性化にも良く、これらの表現型は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびハンチントン病などの神経炎症の状態で持っている根本的な相互作用を理解するための努力にミクログリアに拡張されました。 試験管内の実験では初代ミクログリアを利用生体内環境に拡張することができる迅速かつ信頼性の高い結果を提供しています。これはin vivoでの実験を超える明らかな利点ですが、最適な純度の十分な収量を達成しながら、ミクログリアを分離することが課題となっています。現在使用されている一般的な方法は、どちらかは、低回収率、低純度、またはその両方に苦しみます。ここで、我々はDEM時間の半分の量の高い細胞の回復と強化された純度を実現し、カラムフリーのCD11b磁気分離法の改善onstrate。私たちは、神経炎症および神経変性を研究する目的のための主要なミクログリアの分離の非常に有用なモデルとして、この最適化された方法を提案します。
Introduction
ミクログリアのc-kit + / CD45-から分化中胚葉起源のMybの非依存常駐マクロファージは、卵黄嚢1,2の血島前駆細胞をerythromyeloidれます。発生学的ミクログリアは、中枢神経系（CNS）のコロニーを形成した後、それらは、分枝形態3にアメーバからの遷移します。そのダイナミックな波及効果は、潜在的な侮辱4のための健全な脳実質を探るため、これらの成人ミクログリアは、監視者として分類されています。ミクログリアのみCNS細胞集団の約10％に寄与するものの、お互いの中のタイルへの能力は実質4、5の最大スキャンを保証します。そのようなαシヌクレイン6,7およびアミロイドβ8、又はP等の危険関連分子パターン（DAMPS）そのようなリポ多糖（LPS）9としてathogen関連分子パターン（のPAMPs）は、古典的アメーバ様活性状態への復帰及び一酸化窒素の産生、腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン1βによって特徴付けられる炎症反応を促進するミクログリアを活性化（IL-1β）、IL-6、IL-12、およびケモカインCCモチーフリガンド2 9、10、11。病原αシヌクレインを蓄積してきたパーキンソン病などの神経炎症条件において、神経変性サイクルをさらにミクログリア7の古典的な活性化を促進し、より凝集αシヌクレインを放出するドーパミン作動性ニューロンの死から作成されます。周辺のマクロファージと同様に、ミクログリアはそれらに強力を与える、あるいは抗炎症性サイトカインIL-4およびIL-10の存在下で活性化する能力をも有していてもよいです神経の修復を促進し、炎症2、11の減衰IAL。別にCNSにおける免疫学的役割から、ミクログリアは、開発中のシナプスを剪定することにより、神経回路の重要な調節因子として記載されています。例えば、Cx3cr1- KOマウスは、低密度ミクログリア及び樹状突起棘、未熟シナプス、及び後進CNS 12の電気パターンの過剰につながる減少シナプス剪定を有します。 CNSの恒常性にこれらの生理学的な複雑さとミクログリアの多様な機能的役割を理解することは、神経変性疾患を標的に治療薬を探索するために重要です。
神経免疫学の分野では、in vitroの実験が原因機構研究のための大きな可能性を非常に望ましい、低メンテナンスコスト、およびより少ない時間と労働集約的であるために。 Furthermo再、細胞集団を単離する能力は、所定の条件の下で、それらの標的細胞の機能性を描くことが重要です。多数のミクログリアの分離方法が存在するが、それらは幅広い実験13、14、15のために比較的高い数値と純度を得る能力によって制限されています。例えば、分化11B（のCD11b）のクラスタは、単球、マクロファージおよびミクログリア16の一般的な表面マーカーです。 CD11bを利用することによって、磁気分離の方法は、第一〜99.5％の純度および新生児脳17あたり〜1.6×10 6ミクログリアを得たカラムベースの手法として説明しました。我々の研究室では、最近、我々はフィコエリトリン（PE）にコンジュゲートモノクローナル抗体のCD11bをタグ付けすることによってポリスチレンチューブ中で行わカラムフリーのCD11b磁気分離法15を 、開発しました。二重特異性secondaPEとPEおよびデキストラン複合体にRY抗体。一度結合し、デキストラン被覆磁性粒子は抗体複合体のデキストラン端に結合する、導入されます。最後に、ポリスチレンチューブは、ミクログリアを単離するための磁石内に配置されます。このアプローチは、新生児の脳当たりしかし〜97％までの純度を低下させるコストで〜3.2×10 6ミクログリアの収量を倍増しました。
本明細書において、我々は、迅速かつ精製カラムフリーのCD11b磁気分離プロトコル（ 図1）を実証します。 CD11bを磁気分離キットの価格は同じであるので、この改良された方法は、私たちの元の列フリー法と同様に実現可能なまま。終了時間は、細胞生存および収率を最大に重要であることができる半分に低減されます。注目すべきは、この最適化された方法により達成純度は〜> 99％、当研究室が開発した15元の列のない方法で達成純度を超える顕著な改善です。最も重要なことは、CD11bを-PE光から離れるインキュベートする必要性を排除し、蛍光顕微鏡検査のために赤色チャネルの使用を可能にする、利用されません。最後に、元のCD11bの方法のように、高収率および高純度の星状細胞の画分は、この改良された方法で得られます。アストロサイトは、彼らの恒常性維持機能が病態生理学18との関係で不可欠であるという考えにつながる、CNSの中で最も多数のグリア細胞です。これらのグリア細胞は、神経膠に彼らの捜査の可能性を例示する、栄養サポートを提供し、血液脳関門を形成する神経伝達物質の恒常性の維持、傷害、神経保護に対応してグリアの傷を形成し、学習と記憶、および神経炎症などの多様な生理機能に役割を果たしています生物学19。ミクログリアとアストロサイトの形態と機能はG、共焦点顕微鏡、ウェスタンブロッティング、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を介して確認されていますriess亜硝酸塩アッセイ、およびルミネックス多重サイトカインアッセイ。このプロトコルにより提供される改良は、in vitroの実験のために重要であるすべては、ミクログリアやアストロサイトの純度、赤チャネルの利用可能性を持つ蛍光顕微鏡のより広範なアプリケーションに関連する自信を増加し、時間を節約できます提供しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
古いミクログリアの単離方法は、種々のタンパク質に適していない限られた回復を有するウェスタンブロットによって分析し、RNAは、定量RT-PCRにより解析します。差動付着および軽度のトリプシン処理の方法は、低ミクログリア収率13、14、15を有する2つの一般的なアプローチです。列ベースのCD11bのアプローチは、低い回…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NS088206とES026892：この作品は、国立衛生研究所（NIH）補助金によってサポートされていました。 AKにAGKとディーンズ教授職にW.ユージンとリンダ・ロイド寄附も認めています。
Materials
| EasySep CD11b Separation Kit II | StemCell Technologies | 18970 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| DMEM/F12 (1:1) (1x) | Life Technologies | 11330057 | |
| Sodium Pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| MEM Non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140050 | |
| L-Glutamine (100x) | Life Technologies | 25030081 | |
| EDTA | Fisher Scientific | AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | 13H469 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco by Life Technologies | 25200 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco by Life Technologies | 14190250 |
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