עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי
Summary
הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.
Abstract
הבהרה של מאפייני האיגוד של פילוח כרומטין חלבונים יכולה להיות מאוד מאתגרת בשל האופי המורכב של כרומטין ואת הטבע הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. על מנת להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו הסתגלו assay הפקת מלח רציפים (SSE) להערכת את הזיקות איגוד היחסי של מתחמי מאוגד-כרומטין. זה קל ופשוט assay יכול לשמש על ידי שאינם מומחים כדי להעריך את ההפרש היחסי מחייבים זיקה של שני מתחמי קשורים, השינויים זיקה קומפלקס יחידת משנה אובד או תחום הפרט הוא מומת בשינוי זיקה מחייבת לאחר שינויים לנוף כרומטין. על ידי ברצף מחדש השעיית בצובר כרומטין להגדיל את כמויות מלח, אנחנו יכולים לעשות פרופיל • את תנאי של חלבון מסוים של כרומטין. באמצעות פרופילים אלה, אנו מסוגלים לקבוע כמה שינויים במתחם שינוי כרומטין או שינויים לסביבה כרומטין להשפיע על אינטראקציות מחייב. צימוד SSE עם אחרים מבחני חוץ גופית בתוך וויוו , אנו יכולים לקבוע את התפקידים של תחומים נפרדים, חלבונים על הפונקציונליות של תסביך במגוון סביבות כרומטין.
Introduction
תקנה DNA תאי האיקריוטים היא מערכת מורכב ומתוחכם מפוקחת על ידי מגוון של חלבונים לתאם תגובות לגירויים תאיים, חוץ-תאית. הדנ א הוא כרוך סביב היסטון octamers כדי נוקליאוזומים טופס, שניתן באופן רופף מפוזרים לאורך הדנ א או נדחס לתוך סלילי חזק1. ההסדר המבני הזה של ה-DNA, שינויים היסטוניים המכונה כרומטין, אשר מווסת על ידי רשת של חלבונים לקרוא, לכתוב או למחוק שינויים translational פוסט (PTM) על שינויים היסטוניים2. כמה היסטון PTMs, כגון acetylation, לשנות את המטען של חומצת אמינו ביותר הם מופקדים על, שינוי אינטראקציות בין שינויים היסטוניים דנ א2. היסטון PTMs משמשים גם כדי לגייס הרגולטורים תעתיק, remodelers כרומטין, DNA נזק תיקון מכונות, מכונות שכפול ה-DNA אזורים ספציפיים של גנום3.
רוב שיטות לימוד אינטראקציות כרומטין או בדיקה אינטראקציות בקנה מידה קטן או לערב גדול ניתוחים הגנום כולו. במבחנה מחייב לימודי לנצל לעתים קרובות תחומים רקומביננטי בודדים עם פפטידים היסטון. או דנ א במבחני כגון מבחני shift ניידות אלקטרופורזה (EMSA), calorimetry איזותרמי טיטור, קרינה פלואורסצנטית קיטוב פפטיד pulldowns. כי אלה מבחני להתמקד בדרך כלל תחום חלבונים בודדים, הם להקל על ההבנה של חתיכה קטנה של הפאזל, אך אינם מאפשרים לנו להבין את טבעם קואופרטיב של תחום מרובת חלבונים, שלא לדבר על התפקיד שלהם חלבון רב מתחמי. שכבה נוספת של במאוד נוסף של הקומפוזיציה הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. הטרוגניות חלבון זה, בשילוב עם אופי הדינמי של הנוף כרומטין, הופך אותו מאתגר כדי לסכם את ויוו איגוד אינטראקציות של חלבונים כרומטין כרומטין בתוך חוץ גופית.
שיטות in vivo עשו התקדמות משמעותית; עם זאת, לעתים קרובות הם יקרים, זמן רב, ומאתגר טכנית. Immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף (צ’יפ-seq) הוא מאוד שימושי לקביעת הלוקליזציה של חלבונים ושינויים היסטון ברחבי הגנום, אולם זה דורש אופטימיזציה ניכר4. חלבונים הם לעיתים קרובות תפור כדי כרומטין כדי לשמר את האינטראקציות; עם זאת, זה יכול לייצר אינטראקציות מלאכותי, עלול לגרום epitope מיסוך5. יתר על כן, immunoprecipitations (IP) דורשים נוגדנים ספציפיים מאוד, ואופטימיזציה נרחב של ה-DNA הטיה ומצבים IP על ידי שבב-qPCR שימוש באתר איגוד ידוע, אשר לעתים קרובות אינם זמינים א-פריורי. לאחר אופטימיזציה של שבב תנאים, עיבוד הדגימות יקר ודורש מספר שבועות עד חודשים רצף ולנתח. על פי שיטה זו היא שלא יסולא בפז לזיהוי הלוקליזציה של כרומטין מאוגד חלבונים ברחבי הגנום, העלות ושזה זמן מחויבות אסורה לשימוש בשיטה זו ליצירת היפותזות על מה שינויים קטנים עלול להשפיע על מאפייני האיגוד העולמי .
בנייר זה, אנו מתארים איך וזמינותו הפקת מלח רציפים (SSE) יכול לשמש כדי לבחון פרופילים האיגוד העולמי של חלבוני כרומטין מכורך ולהבחין איך שינויים בפרופיל חלבון, מורכבים, או גלובלי PTM יכול לשנות אינטראקציות. למרות עקירות מלח הם טכניקה בשימוש נפוץ, בהרחבה, נדגים כיצד רציפים בשיטה זו הוא מאוד תכליתי הדירים. SSE מאפשר לנו לאפיין כמה יחידת משנה יחיד של מתחם או אפילו מחשבים בודדת תורמת אהדה גורפת כרומטין הכולל של המתחם. SSE יכול לשמש גם כדי לקבוע אם הכריכה של חלבון מושפע משינויים בנוף כרומטין, מתן השערות מעניין עבור מיקוד מארק היסטון זה יכול להיות מאושרות באמצעות שבב-seq ומחקרים רחב נוספים הגנום.
במקור התאמנו בשיטה זו מ וו ואח ‘, לבחון את הפונקציה של Polybromo1 (PBRM1) באיגוד של6,7פורטל כרומטין PBAF. בעזרת טכניקה זו, אנחנו נקבע את התפקיד של PBRM1 עבור איגוד כרומטין בתוך כרומטין PBAF שיפוץ מורכב, ואז קבעו את התרומה היחסית של שישה bromodomains בודדים זו פונקציה7.
כאן נתאר כיצד לייעל בשיטה זו כדי לחקור את איגוד כרומטין סוגי תאים שונים, כדי להעריך את זיקה מחייבת היחסי של כרומטין דומה שינוי מכלולי כדי לבחון העקירה של חלבון מכרומטין על ידי מעכב כימי, ו כדי לקבוע את ההשפעות של כרומטין מחייב לאחר שינויים לנוף כרומטין.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיון של אינטראקציות חלבון וכרומטין באמצעות עקירות מלח היא שיטה נפוצה זה כבר מועסקים במשך עשרות שנים14,15; עם זאת, זה לא באופן שיטתי מוטבה לפני כדי לחשוף את השירות המלא שלה. נדגים כיצד רציפים בשיטה זו מספק דרך מהירה וזולה כדי להבחין בין שינויים באיגוד כרומטין ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמך על ידי פרס מלומד V (V2014-004) מלומד V בתוספת פרס (D2016-030) מטעם קרן V לחקר הסרטן, וגרנט אמריקאי סרטן החברה מוסדי מחקר (ACS IRG גרנט 58-006-53) למרכז האוניברסיטאי Purdue לסרטן מחקר. א ז. עמ’ נתמכה על ידי פרס הקרן לתואר שני Borch כימיה המרפא של אוניברסיטת פרדו, המחלקה לפרמקולוגיה מולקולרית.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
- Ramakrishnan, V. Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).
- Musselman, C. A., Lalonde, M. -. E., Côté, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, (2017).
- Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting. Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).
- Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma. J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).
- Kerppola, T. K. Polycomb group complexes–many combinations, many functions. Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).
- Filippakopoulos, P., et al. Selective inhibition of BET bromodomains. Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).
- Filippakopoulos, P., et al. Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family. Cell. 149 (1), 214-231 (2012).
- Sanchez, R., Zhou, M. -. M. The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription. Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).
- Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics. Biochim. Biophys. Acta – Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).
- Kakarougkas, A., et al. Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin. Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).
- Lee, S. Y., Park, J. -. H., Kim, S., Park, E. -. J., Yun, Y., Kwon, J. A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks. Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).
- Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin. J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).
