क्रोमेटिन को संशोधित करने के थोक क्रोमेटिन बाइंडिंग गुणों के विश्लेषण के लिए अनुक्रमिक नमक निकालने के परिसरों
Summary
क्रोमेटिन बंधे प्रोटीन के अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण बड़े प्रोटीन परिसरों की बाध्यकारी गुणों का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है । इस विधि को थोक क्रोमेटिन करने के लिए एक प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के समग्र संबध में व्यक्तिगत उपइकाई या डोमेन की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है ।
Abstract
क्रोमेटिन के बाध्यकारी गुणों के Elucidation-लक्ष्यीकरण प्रोटीन बहुत क्रोमेटिन के जटिल प्रकृति और सबसे स्तनधारी क्रोमेटिन के विषम प्रकृति-संशोधित परिसरों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है । आदेश में इन बाधाओं को दूर करने के लिए, हम क्रोमेटिन के सापेक्ष बाध्यकारी समानताएं के मूल्यांकन के लिए एक अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण (SSE) परख अनुकूलित किया है परिसरों । यह आसान और सरल परख गैर द्वारा इस्तेमाल किया जा सकता है विशेषज्ञों के दो संबंधित परिसरों के संबंध बंधन में सापेक्ष अंतर का मूल्यांकन करने के लिए, एक जटिल जब एक उपइकाई खो दिया है या एक व्यक्ति डोमेन निष्क्रिय है के संबंध में परिवर्तन, और में परिवर्तन क्रोमेटिन परिदृश्य को बदलने के बाद समानता बाध्यकारी । क्रमिक रूप से, नमक की मात्रा बढ़ाने में बल्क क्रोमेटिन को सस्पैंड करके, हम क्रोमेटिन से एक विशेष प्रोटीन का रेफरेंस प्रोफाइल कर सकते हैं । इन प्रोफाइल का प्रयोग, हम कैसे एक क्रोमेटिन में परिवर्तन का निर्धारण करने में सक्षम है-जटिल या परिवर्तन क्रोमेटिन पर्यावरण को संशोधित बाध्यकारी बातचीत को प्रभावित । युग्मन SSE के साथ अन्य इन विट्रो में और vivo परख में , हम क्रोमेटिन वातावरण की एक किस्म में एक जटिल की कार्यक्षमता पर व्यक्तिगत डोमेन और प्रोटीन की भूमिकाओं का निर्धारण कर सकते हैं.
Introduction
युकेरियोटिक कोशिकाओं में डीएनए विनियमन एक जटिल और परिष्कृत प्रणाली है कि कसकर प्रोटीन का एक वर्गीकरण है कि intracellular और extracellular उत्तेजनाओं के लिए प्रतिक्रियाओं का समंवय द्वारा नियंत्रित है । डीएनए citrullinated octamers के आसपास लिपटे के लिए nucleosomes फार्म का है, जो ढीला डीएनए के साथ वितरित किया जा सकता है या तंग कुंडल1में संकुचित है । डीएनए और histones के इस संरचनात्मक व्यवस्था क्रोमेटिन, जो प्रोटीन के एक नेटवर्क द्वारा विनियमित है के रूप में जाना जाता है कि पढ़ें, लिखें, और histones पर पोस्ट शोधों संशोधनों (PTM) मिटा2। कुछ citrullinated PTMs, जैसे acetylation, एमिनो एसिड वे पर जमा कर रहे है के प्रभारी बदलने के लिए, histones और डीएनए के बीच बातचीत में फेरबदल2। citrullinated PTMs भी transcriptional नियामकों की भर्ती करने के लिए सेवा, क्रोमेटिन रिमॉडलर, डीएनए क्षति की मरंमत मशीनरी, और डीएनए की प्रतिकृति मशीनरी जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए3।
क्रोमेटिन बातचीत या तो जांच छोटे पैमाने पर बातचीत या बड़े जीनोम व्यापक विश्लेषण शामिल अध्ययन के लिए ज्यादातर तरीके । इन विट्रो में बाध्यकारी अध्ययन अक्सर citrullinated पेप्टाइड्स या ट्रो गतिशीलता बदलाव परख (EMSA), इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry, प्रतिदीप्ति ध्रुवीकरण, और पेप्टाइड pulldowns के रूप में परख में डीएनए के साथ व्यक्तिगत संयोजक डोमेन का उपयोग । क्योंकि इन परख आम तौर पर एक व्यक्ति के प्रोटीन डोमेन पर ध्यान केंद्रित, वे पहेली का एक छोटा सा टुकड़ा की समझ की सुविधा है, लेकिन हमें बहु के सहकारी प्रकृति-डोमेन प्रोटीन को समझने की अनुमति नहीं है, अकेले जाने बहु में अपनी भूमिका प्रोटीन परिसरों. intricacy की एक और परत सबसे स्तनधारी क्रोमेटिन के विषम संरचना द्वारा जोड़ा गया है-परिसरों को संशोधित । इस प्रोटीन विविधता, क्रोमेटिन परिदृश्य के गतिशील प्रकृति के साथ संयोजन में, यह दोहराऊंगा के लिए क्रोमेटिन प्रोटीन के vivo बाध्यकारी बातचीत में क्रोमेटिन करने के लिए चुनौतीपूर्ण बनाता है इन विट्रो।
vivo में तरीकों ने महत्वपूर्ण प्रगति की है; हालांकि, वे अक्सर महंगे हैं, समय लगता है, और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण । क्रोमेटिन immunoprecipitation sequencing द्वारा पीछा किया (चिप-seq) जीनोम भर में प्रोटीन और citrullinated संशोधनों के स्थानीयकरण का निर्धारण करने के लिए बहुत उपयोगी है, लेकिन यह पर्याप्त अनुकूलन4की आवश्यकता है. प्रोटीन अक्सर crosslinked को क्रोमेटिन करने के लिए बातचीत की रक्षा कर रहे हैं; हालांकि, इस कृत्रिम बातचीत का उत्पादन कर सकते है और epitope मास्किंग5कारण हो सकता है । इसके अलावा, immunoprecipitations (आईपी) अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है, और चिप द्वारा डीएनए कतरनी और आईपी शर्तों के व्यापक अनुकूलन-qPCR एक ज्ञात बंधन साइट है, जो अक्सर उपलब्ध नहीं है का उपयोग कर एक प्राथमिकताओं। चिप शर्तों के अनुकूलन के बाद, नमूनों की प्रोसेसिंग महंगा है और अनुक्रम और विश्लेषण करने के लिए महीनों के लिए कई हफ्तों की आवश्यकता है । हालांकि इस विधि के जीनोम भर में क्रोमेटिन बाध्य प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान के लिए अमूल्य है, लागत और समय प्रतिबद्धता यह इस विधि का उपयोग करने के लिए कैसे छोटे परिवर्तन वैश्विक बाध्यकारी गुणों को प्रभावित कर सकता है के बारे में परिकल्पनाओं उत्पंन करने के लिए प्रतिबंधित कर .
इस पत्र में, हम वर्णन कैसे एक अनुक्रमिक नमक निष्कर्षण (SSE) परख के लिए क्रोमेटिन-बाध्य प्रोटीन की वैश्विक बाध्यकारी प्रोफाइल की जांच और भेद कैसे एक प्रोटीन, जटिल, या वैश्विक PTM प्रोफ़ाइल में परिवर्तन बातचीत बदल सकते है इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि नमक निकालने एक सामांयतः और मोटे तौर पर तकनीक का इस्तेमाल कर रहे हैं, हम प्रदर्शन कैसे इस अनुक्रमिक विधि अत्यधिक प्रतिलिपि और बहुमुखी है । SSE हमें अनुमति देता है कि कैसे एक जटिल या यहां तक कि एक डोमेन के एक उपइकाई थोक क्रोमेटिन के लिए जटिल समग्र संबंध के लिए योगदान की विशेषता है । SSE भी अगर एक प्रोटीन की बाध्यकारी क्रोमेटिन परिदृश्य में परिवर्तन से प्रभावित है, यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है citrullinated निशान लक्ष्यीकरण कि चिप seq और अंय जीनोम व्यापक अध्ययन का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है के लिए दिलचस्प परिकल्पना प्रदान करते हैं ।
हम मूलतः वू एट अल से इस पद्धति को अनुकूलित, Polybromo1 (PBRM1) के समारोह की जांच करने के लिए PBAF क्रोमेटिन रिमॉडलर6,7के बंधन में । इस तकनीक का प्रयोग, हम PBAF क्रोमेटिन remodeling परिसर के भीतर बाध्यकारी क्रोमेटिन के लिए PBRM1 की भूमिका निर्धारित की है और फिर इस समारोह में छह व्यक्ति bromodomains के सापेक्ष योगदान निर्धारित7।
यहां हम वर्णन कैसे इस विधि का अनुकूलन करने के लिए विभिंन प्रकार के सेल में क्रोमेटिन बंधन का पता लगाने के लिए, इसी तरह के क्रोमेटिन के सापेक्ष बाध्यकारी संबंध का आकलन करने के लिए जटिल संशोधित, एक रासायनिक अवरोध करनेवाला द्वारा क्रोमेटिन से एक प्रोटीन के विस्थापन की जांच, और क्रोमेटिन लैंडस्केप करने के लिए परिवर्तन के बाद क्रोमेटिन बाध्यकारी के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए ।
Protocol
1. तैयारी hypotonic समाधान बफ़र A: ०.३ M सुक्रोज, ६० mm KCl, ६० mm Tris पीएच ८.०, 2 मिमी EDTA, और ०.५% NP-४० के १०० मिलीलीटर तैयार करें । दुकान पर 4 & #186; ग. नोट: कुछ कक्ष रेखाओं, जैसे HEK293T, कम सख़्त lysing स्थितियों की आवश्यकता होती है ।…
Representative Results
Discussion
नमक के अर्क के माध्यम से प्रोटीन और क्रोमेटिन बातचीत का लक्षण वर्णन एक आम तरीका है कि दशकों के लिए नियोजित किया गया है14,15; हालांकि, इसकी पूरी उपयोगिता प्रकट करने से पहले इसे व्यवस्थ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य के लिए वी फाउंडेशन से कैंसर अनुसंधान के लिए एक वी विद्वान पुरस्कार (V2014-004) और एक वी विद्वान प्लस पुरस्कार (D2016-030), और एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी संस्थागत अनुसंधान अनुदान (ACS IRG अनुदान 58-006-53) द्वारा समर्थन किया गया इन्होने कैंसर के लिए विश्वविद्यालय केंद्र अनुसंधान. ई. जी. पी. इन्होने विश्वविद्यालय के औषधीय रसायन एवं आणविक औषध विज्ञान विभाग को Borch स्नातक बंदोबस्ती पुरस्कार से समर्थन दिया था.
Materials
| Sodium Chloride, Crystal 2.5 Kg AR (ACS) | Avantor/Macron | 7581-06 | |
| Sucrose, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 8360-04 | |
| Potassium Chloride, Granular 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 6858-04 | |
| Trizma(R) base,Primary Standard and Buffer, >=99.9% (titration), crystalline | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| EDTA (Ethylenedinitrilo) Tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate 125 G AR (ACS) | Avantor/Macron | 4931-02 | |
| NONIDET P-40 SUBSTRATE, 100mL UN3082 | Amresco | E109-100ML | |
| HEPES Buffer Solution (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Magnesium Chloride, 6-Hydrate, Crystal 500 G AR¨ (ACS) | Avantor/Macron | 5958-04 | |
| GLYCEROL, 1L | Amresco | 0854-1L | |
| DEOXYCHOLIC ACID SODIUM SALT, 100g | Amresco | 0613-100G | |
| Eppendorf Research plus pipette | Fisher Scientific | 13-690-032 | |
| Eppendorf 5424 R refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | 5424 R | |
| Secondary mouse IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7076 | |
| Secondary rabbit IgG HRP-linked | Cell Signaling | 7074 | |
| BMI-1 antibody | Millipore | ||
| PBRM1 antibody | Bethyl | A301-591A | |
| ARID1a antibody | Santa Cruz | sc-32761 | |
| BRD4 antibody | Bethyl | A301-9852a | |
| (+) JQ1 | Cayman Chemical Company | 11187 | |
| SAHA | Cayman Chemical Company | 10009929 | |
| Doxorubicin | AK Scientific | 25316-40-9 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Macron | 4948-02 | |
| Mini Trans-Blot Cell | BioRad | 1703930 | |
| Mini Gel Tank | ThermoFisher | A25977 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | Amresco | 0332-100g | Used in as a 5% solution in PBS-T as blocking solution for Western blots |
| Bolt MOPS SDS Running Buffer (20x) | Life Technologies | B0001 | |
| Bolt LDS Sample Buffer (4x) | Life Technologies | B0007 | |
| PageRuler Plus Prestained Protein Ladder, 10 to 250 kDa | ThermoFisher | 26619 | |
| Methyl Alcohol, Anhydrous | Macron | 3041-10 | |
| Trypsin kEDTA, 1X | Cellgro | 25-053-CI | |
| SODIUM AZIDE, 250g UN1687 | Amresco | 0639-250G | |
| SODIUM DODECYL SULFATE (SDS)500g UN1325 | Amresco | 0227-500G | |
| Glycine,for electrophoresis, >=99% | Sigma-Aldrich | G8898-1kg | |
| BigTop Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR | 20170-333 | |
| 1000 µL Pipet Tips | VWR | 83007-382 | |
| NuPAGE Bis-Tris Precast Gels 4-12% | Invitrogen | NW04125BOX | |
| Leupeptin Hemisulfate, 5 MG | RPI Research Products | 22035-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| APROTININ, 10 MG | RPI Research Products | 20550-0.01 | Used for Protease inhibitor solution. |
| PEPSTATIN A, 5 MG | RPI Research Products | 30100-0.005 | Used for Protease inhibitor solution. |
| OVCA429 cells | Gift from Karen Cowden Dahl. Ph.D. | ||
| HEK293T | ATCC | CRL-3216 | |
| HeLa cells | ATCC | CCL-2 | |
| McCoy's 5A media | Corning Mediatech | 10-050-CV | |
| DMEM | Corning Mediatech | 10-013-CV | |
| Minimum Essential Medium (MEM), Powder | Corning Mediatech | 50-011-PC | |
| MEM NEAA (100X) non-essential amino acid | Gibco | 11140-050 | |
| FB-11: Fetal Bovine Serum, U.S. Source | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Life Technologies | 15140-122 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| sodium pyruvate | Life Technologies | 11360070 | |
| VWR Power Source | VWR | 13-690-032 |
References
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